Assessing the stereoselectivity of carbonyl reductases toward the reduction of OPBE and docking analysis
- 作者
- Rong Chen, Jian Deng, Jinping Lin, Xiaopu Yin, Tian Xie, Shengli Yang, Dongzhi Wei
- 单位
- State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, New World Institute of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai, People's Republic of China; Center for Biomedicine and Health, Division of Basical Medicine, Hangzhou Normal University, Hangzhou, People's Republic of China
- 杂志
- Biotechnology and Applied Biochemistry（2015）
- DOI
- 10.1002/bab.1397
- 所属领域
- 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
评估一系列羰基还原酶对OPBE不对称还原的立体选择性，并探究酶-底物-辅因子相互作用如何决定还原产物的构型。
研究策略
构建含30个羰基还原酶的酶库，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，以OPBE为底物筛选立体选择性；对高选择性酶SeCR和GoKR进行酶学动力学表征，并通过同源建模和分子对接分析其催化机理。
研究路线图
核心内容
该研究构建了包含30个羰基还原酶的酶库，在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达后，以OPBE为底物筛选不对称还原的立体选择性。结果显示约30%的酶产生(S)-HPBE，其余主要产生(R)-HPBE。其中来自酿酒酵母的SeCR和来自氧化葡糖杆菌的GoKR表现出优异的对映体选择性，分别以大于99%的对映体过量值催化OPBE还原为(R)-HPBE和(S)-HPBE，转化率分别为大于99%和93.1%。动力学表征显示SeCR的比活力为29.0 U/mg，Km为0.22 mM，kcat/Km为11.14 s⁻¹ mM⁻¹；GoKR的比活力为7.2 U/mg，Km为2.97 mM，kcat/Km为17.19 s⁻¹ mM⁻¹。通过同源建模和分子对接分析，发现SeCR-NADPH复合物中氢化物从OPBE的re面转移，而GoKR-NADPH复合物中从si面转移，从而决定了产物构型。该研究揭示了酶的三维结构通过控制底物与辅因子NADPH的相对几何排列来调控立体选择性，为根据底物结构预测不对称还原产物的构型提供了结构基础。
创新点
发现SeCR和GoKR分别以100% e.e.产生(R)-HPBE和(S)-HPBE；通过对接分析揭示了Prelog与anti-Prelog选择性的结构基础。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 不对称还原 | SeCR (GenBank: NM_001180183) | carbonyl reductase from Saccharomyces cerevisiae (SeCR) | 催化 | 催化OPBE还原为(R)-HPBE，e.e.>99%，转化率>99%，比活力29.0 U/mg，Km 0.22 mM |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 不对称还原 | GoKR (GenBank: YP_190959) | short-chain dehydrogenase from Gluconobacter oxydans (GoKR) | 催化 | 催化OPBE还原为(S)-HPBE，e.e.>99%，转化率93.1%，比活力7.2 U/mg，Km 2.97 mM |
关键发现
- 在30个被测试的羰基还原酶中，约30%（9个）产生(S)-HPBE，其余主要产生(R)-HPBE。SeCR（来自酿酒酵母）催化OPBE还原为(R)-HPBE，转化率>99%，e.e.>99%，比活力29.0 U/mg，Km为0.22 mM，kcat为2.45 s⁻¹，kcat/Km为11.14 s⁻¹ mM⁻¹
- GoKR（来自氧化葡糖杆菌）催化OPBE还原为(S)-HPBE，转化率93.1%，e.e.>99%，比活力7.2 U/mg，Km为2.97 mM，kcat为51.04 s⁻¹，kcat/Km为17.19 s⁻¹ mM⁻¹。分子对接显示SeCR-NADPH复合物中氢化物从OPBE的re面转移，而GoKR-NADPH复合物中从si面转移，决定产物构型。
研究结论
酶的三维结构通过控制底物与辅因子NADPH的相对几何排列来调控立体选择性，可根据底物结构预测不对称还原产物的构型。