Vector promoters used in Klebsiella pneumoniae
- 作者
- Xiao Jiang, Chengqian Zhu, Jie Lin, Jingkang Li, Shuilin Fu, Heng Gong
- 单位
- State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai, People's Republic of China
- 杂志
- Biotechnology and Applied Biochemistry（2015）
- DOI
- 10.1002/bab.1423
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
肺炎克雷伯菌代谢工程中可用的启动子实际表达水平未知，缺乏系统性比较，导致基因表达调控难以精确匹配需求。
研究策略
利用lacZ报告基因，在肺炎克雷伯菌KG1中系统比较三个启动子（Ptac、PT5、Pbud）在不同碳源（LB、葡萄糖、甘油）下的表达强度、稳定性及诱导特性，并与大肠杆菌DH5α进行对照。
研究路线图
核心内容
本研究以lacZ为报告基因，在肺炎克雷伯菌KG1中系统比较了Ptac、PT5和内源Pbud三个启动子在不同碳源下的表达强度与诱导特性，并与大肠杆菌DH5α对照。结果表明，来源于大肠杆菌的启动子在肺炎克雷伯菌中功能保留但特性改变：无诱导时Ptac的β-半乳糖苷酶活性达396.5 U/mg，比PT5高9.5倍，呈现高效组成型表达特征；IPTG诱导后活性升至30321.3 U/mg，与DH5α相当，但诱导/抑制比从DH5α的246倍降至76.5倍，说明其调控动态范围收窄。内源Pbud在LB和甘油培养基中均为稳定弱启动子，活性约26~29 U/mg。三个启动子在KG1中的表达覆盖约1000倍范围（26.6~30321.3 U/mg）。该工作首次明确Ptac在肺炎克雷伯菌中可作为高效组成型启动子，并构建了内源弱启动子Pbud，二者组合可满足该菌在甘油培养基中广泛的基因表达调控需求，为代谢工程途径优化提供了可靠的启动子选择依据。
创新点
首次证明Ptac在肺炎克雷伯菌中可作为高效“组成型”启动子；构建了来源于bud操纵子的新型内源弱启动子Pbud；阐明了碳源对启动子强度和稳定性的影响，为工程改造提供了启动子选择依据。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella pneumoniae KG1 | 1,3-丙二醇合成 | — | — | 调控 | 底盘细胞，高1,3-丙二醇生产菌株，用于启动子比较 |
| Escherichia coli DH5α | 基因表达 | — | — | 调控 | 对照宿主，用于比较启动子异源表达特性 |
| Klebsiella pneumoniae KG1 | 2,3-丁二醇生物合成 | Pbud | — | 调控 | 内源组成型启动子，克隆自bud操纵子上游121 bp片段，来自KG1基因组 |
| Klebsiella pneumoniae KG1 | 异源表达 | Ptac | — | 调控 | 异源诱导型启动子，来自pGEX-4T-1，由IPTG诱导 |
| Klebsiella pneumoniae KG1 | 异源表达 | PT5 | — | 调控 | 异源组成型启动子，序列来自T5噬菌体，人工合成 |
| Klebsiella pneumoniae KG1 | 报告基因表达 | lacZ | β-半乳糖苷酶 | 催化 | 报告基因，催化ONPG水解，用于定量启动子强度 |
| Escherichia coli DH5α | 报告基因表达 | lacZ | β-半乳糖苷酶 | 催化 | 对照宿主中的报告基因 |
关键发现
- 在肺炎克雷伯菌KG1中，无诱导时Ptac的β-半乳糖苷酶活性达396.5 U/mg，比PT5高9.5倍
- IPTG诱导后活性达30321.3 U/mg，与DH5α相当（37544.2 U/mg）
- Ptac在KG1中的诱导/抑制比从DH5α的246倍降至76.5倍。Pbud和PT5在LB中活性分别为26.6和41.9 U/mg，在甘油培养基中Pbud峰值达28.9 U/mg，Ptac无诱导和有诱导时分别达575.4和42411.2 U/mg。三个启动子在KG1中的表达覆盖约1000倍范围（26.6~30321.3 U/mg）。
研究结论
来源于E. coli的启动子在肺炎克雷伯菌中有功能但特性发生改变，Ptac具有高基础和高诱导表达特性，内源Pbud是稳定弱启动子；组合使用Pbud和Ptac可满足肺炎克雷伯菌在甘油培养基中约1000倍范围的基因表达需求。