Taxadiene-5α-ol is a minor product of CYP725A4 when expressed in Escherichia coli
- 单位
- Department of Plant Biology, Southern Illinois University, Carbondale, IL, USA
- 杂志
- Biotechnology and Applied Biochemistry（2017）
- DOI
- 10.1002/bab.1606
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中异源表达CYP725A4时，主要形成非天然副产物OCT和iso-OCT，目标产物紫杉二烯-5α-醇（T5α-ol）产量很低，制约了紫杉醇前体的微生物合成。
研究策略
构建共表达MEP途径基因（dxs、dxr、idi）、GGPPS、紫杉二烯合酶（TS）和CYP725A4的大肠杆菌菌株，比较不同来源的P450还原酶（Taxus CPR、人NPR）及细胞色素b5对CYP725A4产物谱的影响，并通过GC-MS检测分析产物。
研究路线图
核心内容
该研究在大肠杆菌中重建紫杉醇前体合成途径，通过共表达MEP途径基因、GGPPS、紫杉二烯合酶（TS）及CYP725A4，系统考察不同来源P450还原酶（紫杉CPR、人NPR）和细胞色素b5对CYP725A4产物谱的影响。GC-MS分析表明，TS主要生成endotaxadiene（87–94%）和少量exotaxadiene（5–13%），而CYP725A4氧化紫杉二烯时目标产物紫杉二烯-5α-醇（T5α-ol）仅为次要产物，产量比主要副产物OCT低约10倍。改变还原酶来源或采用融合蛋白/双顺反子连接方式均不改变T5α-ol比例，共表达紫杉细胞色素b5反而抑制P450总活性，使OCT和iso-OCT水平降低且检测不到T5α-ol。研究还指出，此前文献报道的高达58 mg/L的“T5α-ol”和1 g/L“taxadiene”中，相关色谱峰实际可能为iso-OCT，酵母体系中T5α-ol也仅达25 μg/L。上述结果意味着，依赖现有CYP725A4在大肠杆菌中难以高效合成T5α-ol，需另辟蹊径，如改造TS使其主要产生exotaxadiene底物，或筛选能特异羟化生成T5α-ol的新型酶。
创新点
独立证实T5α-ol只是CYP725A4在大肠杆菌中的次要产物；发现改变CPR来源和连接方式不改变T5α-ol比例，而Cb5抑制总体活性；质疑并纠正了文献中将iso-OCT误认为T5α-ol的结论。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli C41(DE3) | MEP pathway | dxs | DXS | 催化 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 |
| Escherichia coli C41(DE3) | MEP pathway | dxr | DXR | 催化 | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶 |
| Escherichia coli C41(DE3) | MEP pathway | idi | IDI | 催化 | 异戊烯基二磷酸异构酶 |
| Escherichia coli C41(DE3) | 萜类前体合成 | ggpps | GGPPS | 催化 | 牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶 |
| Escherichia coli C41(DE3) | 紫杉醇生物合成 | coTS79 | TS | 催化 | 截短的紫杉二烯合酶，催化GGPP环化生成紫杉二烯 |
| Escherichia coli C41(DE3) | 紫杉醇生物合成 | CYP725A4 | CYP725A4 | 催化 | 紫杉二烯5α-羟化酶，主要产生OCT和iso-OCT，T5α-ol为次要产物 |
| Escherichia coli C41(DE3) | P450电子传递 | TCPR | TCPR | 能量供给 | 红豆杉细胞色素P450还原酶，为CYP725A4提供电子 |
| Escherichia coli C41(DE3) | P450电子传递 | hNPR | hNPR | 能量供给 | 人NADPH:P450还原酶，可替代TCPR支持CYP725A4活性 |
| Escherichia coli C41(DE3) | P450电子传递 | TxCb5 | TxCb5 | 调控 | 红豆杉细胞色素b5，共表达后降低CYP725A4产物总量 |
关键发现
- 大肠杆菌中TS的主要产物为endotaxadiene（87-94%），次要产物为exotaxadiene（5-13%）
- 工程菌中T5α-ol产量比OCT少约10倍
- OCT:iso-OCT比率在融合蛋白和hNPR双顺反子体系中约为1.5:1，在TCPR双顺反子体系中约为1:1
- 共表达Taxus Cb5后OCT和iso-OCT水平降低，未检测到T5α-ol
- 文献中报道的'1 g/L taxadiene'和'58 mg/L T5α-ol'中的'T5α-ol'峰实际可能为iso-OCT
- 酵母中表达TS和CYP725A4时T5α-ol仅25 μg/L。
研究结论
在大肠杆菌中，CYP725A4催化紫杉二烯主要生成非天然副产物OCT和iso-OCT，T5α-ol仅为次要产物；不同氧化还原伴侣不能改善T5α-ol比例，Cb5反而降低活性。因此需要寻找其他策略（如改造TS使其主要产生exotaxadiene，或筛选只产生T5α-ol的新羟化酶）来有效合成紫杉醇前体。