Characterization of γ-terpinene synthase from Citrus unshiu (Satsuma mandarin)
- 作者
- Yukiko Suzuki, Hiroshi Sakai, Takehiko Shimada, Mitsuo Omura, Shigenori Kumazawa, Tsutomu Nakayama
- 单位
- Department of Food and Nutritional Sciences, University of Shizuoka; Laboratory of Biotechnology, Department of Citrus Research, Okitsu NIFTS NARO
- 杂志
- BioFactors
- DOI
- 10.1002/biof.552210115
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
柑橘来源的γ-萜品烯合酶（CitMTSL3）在大肠杆菌中难以大量可溶性表达，且该酶的催化机制尚未完全阐明。
研究策略
去除CitMTSL3的质体靶向信号，利用携带额外argU tRNA基因的大肠杆菌BL21(DE3)-CodonPlus-RIL菌株进行异源表达，通过降低诱导温度提高可溶性蛋白量，并用GC/MS鉴定酶促产物。
研究路线图
核心内容
该研究针对柑橘来源的γ-萜品烯合酶CitMTSL3在大肠杆菌中难以可溶性表达的问题，通过去除其质体靶向信号肽，并利用携带额外argU tRNA基因的BL21(DE3)-CodonPlus-RIL菌株进行异源表达，同时将诱导温度从37°C降至20°C或30°C，显著提高了可溶性蛋白产量。结果显示，去除信号肽的N2构建体在37°C诱导时可溶与不可溶蛋白几乎各半，而全长N1构建体大部分为包涵体；低温诱导进一步增加可溶性酶量。MALDI-TOF MS确认N2蛋白分子量为63894.8 Da，与理论值一致。酶促反应以767 μM香叶基焦磷酸为底物、2 mM MgCl2和MnSO4为辅因子，GC/MS分析表明主要产物为γ-萜品烯（保留时间10.13 min），副产物α-蒎烯、β-蒎烯和柠檬烯含量极低。该工作首次实现了Satsuma mandarin来源γ-萜品烯合酶在大肠杆菌中的功能性表达，证实其催化GPP环化生成γ-萜品烯，为后续定点突变和晶体结构解析奠定了蛋白材料基础。
创新点
首次实现了Satsuma mandarin来源γ-萜品烯合酶在大肠杆菌中的功能性表达，并发现去除质体靶向信号可显著减少包涵体形成。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)-CodonPlus-RIL | 单萜生物合成 | CitMTSL3 (AB110639) | γ-terpinene synthase | 催化 | 去除质体靶向信号的N2构建体，催化GPP环化生成γ-萜品烯；宿主携带argU tRNA基因以优化稀有密码子表达。 |
关键发现
- 去除质体靶向信号后，37°C诱导时N2构建体的可溶与不可溶蛋白几乎各半，而N1（全长）大部分不可溶
- 降低温度至20°C或30°C可提高可溶性酶量。MALDI-TOF MS测得N2表达蛋白分子量为63894.8，与理论值一致。酶反应（GPP浓度767 μM，MgCl2 2 mM，MnSO4 2 mM）主要产物为γ-萜品烯，GC保留时间10.13 min，副产物α-蒎烯（7.81 min）、β-蒎烯（8.58 min）和柠檬烯（9.64 min）含量很小。
研究结论
通过去除质体靶向信号和利用特殊大肠杆菌菌株，获得了足量的可溶性γ-萜品烯合酶，并确认其主要催化GPP环化生成γ-萜品烯，为后续定点突变和晶体结构研究奠定了基础。