Expression of an acetyl-CoA synthase and a CoA-transferase in Escherichia coli to produce modified taxanes in vivo
- 作者
- Catherine Loncaric, Amanda F. Ward, Kevin D. Walker
- 单位
- Departments of Chemistry, Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, East Lansing, MI, USA
- 杂志
- Biotechnology Journal（2007）
- DOI
- 10.1002/biot.200600194
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中实现紫杉醇前体——10-脱乙酰巴卡丁III（10-DAB）的C10位酰基修饰，生产巴卡丁III及其丙酰、丁酰类似物，为第二代紫杉醇衍生物提供前体。
研究策略
将来自红豆杉的10-脱乙酰巴卡丁III 10β-O-乙酰转移酶（DBAT）与大肠杆菌内源的乙酰-CoA合成酶（ACS）或重组表达的乙酰乙酸:乙酰-CoA CoA转移酶（AtoAD）偶联，通过外源补充乙酸、丙酸或丁酸，利用细胞内生成的相应酰基-CoA供体，实现10-DAB的体内酰基化。
研究路线图
核心内容
本研究在大肠杆菌中构建了紫杉醇前体10-脱乙酰巴卡丁III（10-DAB）的C10位酰基化工程菌，以实现巴卡丁III及其丙酰、丁酰类似物的体内生产。研究者将红豆杉来源的10-脱乙酰巴卡丁III 10β-O-乙酰转移酶（DBAT）与大肠杆菌内源乙酰-CoA合成酶（ACS）或异源乙酰乙酸:乙酰-CoA CoA转移酶（AtoAD）共表达，通过外源补充乙酸、丙酸或丁酸，利用胞内生成的相应酰基-CoA供体驱动酰化反应。结果显示，在5 mM丙酸条件下，10-DAB转化为10-丙酰基巴卡丁III的转化率达13±1.0%，较无外源丙酸时提高约5倍；共表达dbat和atoAD的菌株在25 mM丁酸条件下可产生10-丁酰基巴卡丁III，最高转化率为2.6±0.5%，延长培养至6天后可达4.5±0.5%。体外酶动力学表明，DBAT对丙酰-CoA的催化效率约为乙酰-CoA的一半，对丁酰-CoA约为其1/20。该研究首次证明通过偶联内源ACS或异源AtoAD与外源短链脂肪酸补料，可在E. coli中实现10-DAB的非天然酰基化，为第二代紫杉醇衍生物前体的半生物合成提供了可行途径。
创新点
['首次在E. coli中通过共表达dbat和atoAD实现10-丁酰基巴卡丁III（10-DABB）的体内生产', '证明E. coli内源ACS能够激活丙酸生成丙酰-CoA，支持DBAT合成10-丙酰基巴卡丁III（10-DAPB）', '建立了利用工程菌生产第二代紫杉醇衍生物前体的半生物合成方法']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109 | 紫杉醇生物合成 | dbat | 10-deacetylbaccatin III 10β-O-acetyltransferase (DBAT) | 催化 | 来自Taxus，催化酰基从酰基-CoA转移至10-DAB的C10羟基 |
| Escherichia coli JM109 | 乙酸盐/丙酸代谢 | acs | Acetyl-CoA synthase (ACS) | 催化 | 内源酶，激活乙酸和丙酸为相应CoA酯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 脂肪酸降解/丁酸代谢 | atoAD | Acetoacetate:acetyl-CoA CoA-transferase (AtoAD) | 催化 | 由ato操纵子编码，激活丁酸和乙酰乙酸为CoA酯 |
关键发现
- ['在E. coli JM109中表达dbat，外源补充乙酸（1-5 mM）对巴卡丁III的转化率约为10%，与不添加乙酸时相似', '在5 mM丙酸条件下，10-DAB转化为10-DAPB的转化率为13±1.0%，较无外源丙酸时的2.0±0.9%提高约5倍', '在1 mM和2 mM丙酸条件下，10-DAPB转化率分别为8.0±1.4%和9.9±1.0%', '共表达dbat和atoAD的E. coli BL21(DE3)在25 mM丁酸条件下，10-DABB最高转化率为2.6±0.5%
- 无外源丁酸时约为0.6%', '延长培养至6天（25 mM丁酸）时，10-DABB转化率可达4.5±0.5%', 'E. coli内源乙酰-CoA浓度>250 μM，DBAT对乙酰-CoA的Km为8 μM', 'DBAT对丙酰-CoA的体外催化效率约为乙酰-CoA的一半，对丁酰-CoA的催化效率约为乙酰-CoA的1/20']
研究结论
在E. coli中通过表达DBAT并偶联合适的酰基-CoA活化酶（内源ACS或异源AtoAD），能够利用外源短链脂肪酸实现10-DAB的体内C10位酰基化，生产巴卡丁III及其非天然类似物（10-DAPB和10-DABB）。该方法为第二代紫杉醇衍生物的半生物合成提供了可行途径，且有望通过代谢工程进一步优化。