A simple and reliable method to conduct and monitor expression cassette integration into the Escherichia coli chromosome
- 作者
- Christoph Albermann, Natalie Trachtmann, Georg A. Sprenger
- 单位
- Institute of Microbiology, Universitat Stuttgart, Stuttgart, Germany
- 杂志
- Biotechnology Journal（2009）
- DOI
- 10.1002/biot.200900193
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
质粒表达系统存在结构不稳定和需抗生素维持等缺陷，需要一种简单可靠的方法将表达盒稳定整合到大肠杆菌染色体上，以实现多步异源生物合成途径的稳定表达。
研究策略
利用大肠杆菌中稀有且非必需的糖降解基因位点作为整合靶点，通过λ-Red重组系统将携带表达盒的PCR产物整合到染色体上，并使用含有相应糖的MacConkey固体差异培养基筛选浅色（pale）菌落，以准确监测整合事件。以Pantoea ananatis的玉米黄质（zeaxanthin）生物合成途径为例，逐步整合crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ基因。
核心内容
针对质粒表达系统稳定性差、依赖抗生素维持等局限，本研究建立了一种将外源表达盒稳定整合入大肠杆菌染色体简单可靠的方法。该方法以染色体上稀有且非必需的糖降解基因位点为整合靶点，利用λ-Red重组系统将PCR扩增的线性表达盒整合入染色体，并借助含对应糖的MacConkey差异培养基筛选浅色菌落以准确区分正确整合与假阳性克隆。以Pantoea ananatis玉米黄质合成途径为模型，通过连续替换多个糖降解位点，无标记地逐步整合crtE、crtB、crtI、crtY和crtZ五个基因。结果表明，整合后假阳性比例可达20%至70%，而浅色菌落全部为正确的位点特异性整合，整合片段长度可达6 kb。构建的工程菌株经超过100代培养及15 L规模补料分批发酵，插入基因未发生丢失或迁移，产物稳定生成，成功获得产玉米黄质的菌株BW-ZEA。该方法为大肠杆菌中复杂异源途径的稳定组装与工业化生产提供了高效可靠的工具。
创新点
提出利用MacConkey糖发酵指示培养基进行准确筛选，有效区分正确整合与假阳性克隆；展示了通过连续替换多个糖降解基因位点，无标记地逐步组装复杂异源生物合成途径。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BW25113 Lac+ | 类胡萝卜素生物合成 | crtE | CrtE (GGPP合酶) | 催化 | 整合于malEFG位点，催化异戊烯基焦磷酸生成香叶基香叶基焦磷酸 |
| Escherichia coli BW25113 Lac+ | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | CrtB (八氢番茄红素合酶) | 催化 | 整合于fucPIK位点，催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素 |
| Escherichia coli BW25113 Lac+ | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI (八氢番茄红素脱氢酶) | 催化 | 整合于xylAB位点，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| Escherichia coli BW25113 Lac+ | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | CrtY (番茄红素β-环化酶) | 催化 | 整合于lacZYA位点，催化番茄红素环化生成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli BW25113 Lac+ | 类胡萝卜素生物合成 | crtZ | CrtZ (β-胡萝卜素羟化酶) | 催化 | 整合于melAB位点，催化β-胡萝卜素羟化生成玉米黄质 |
关键发现
- 在λ-Red重组整合后，MacConkey平板上假阳性克隆比例高达20%-70%（表现为有抗生素抗性但菌落呈红色），而所有浅色菌落均验证为正确的位点特异性整合
- 整合的线性DNA片段长度可达6 kb
- 构建的工程菌株经超过100代培养及15 L规模补料分批发酵后，未检测到插入基因的丢失或迁移，产物生成稳定
- 成功构建了产玉米黄质的大肠杆菌菌株BW-ZEA。
研究结论
将λ-Red重组系统与差异培养基筛选相结合，建立了一种高效、可靠、无标记的染色体整合方法，适用于大肠杆菌中复杂外源生物合成途径的逐步组装与稳定生产，具备良好的工业应用前景。