Pseudomonas aeruginosa amidase: Aggregation in recombinant Escherichia coli
- 作者
- Patricia Borges, Rita Pacheco, Amin Karmali
- 单位
- Centro de Investigação de Engenharia Química e Biotecnologia do Instituto Superior de Engenharia de Lisboa, Rua Conselheiro Emídio Navarro, Lisboa, Portugal
- 杂志
- Biotechnology Journal（2011）
- DOI
- 10.1002/biot.201000321
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
重组大肠杆菌中铜绿假单胞菌酰胺酶表达时易形成不溶性聚集体，影响可溶蛋白产量；需要研究培养条件对聚集的影响并开发温和溶解活性聚集体以回收酶的方法
研究策略
系统考察培养温度（25°C、37°C）、IPTG浓度（0.1-1 mM）以及3% v/v乙醇冲击对重组E. coli中酰胺酶在可溶与不溶级分中产量和活性的影响；利用FTIR光谱分析聚集体二级结构；用L-精氨酸进行非变性溶解并比较GdnHCl
研究路线图
核心内容
该研究系统考察了培养条件对重组大肠杆菌中铜绿假单胞菌酰胺酶表达的影响。通过调整培养温度（25°C、37°C）、IPTG浓度及3%乙醇冲击，发现所有条件下酰胺酶均以可溶与不溶聚集体形式共存，且不溶聚集体具有催化活性。37°C、0.4 mM IPTG加乙醇时，可溶性酰胺酶比活力最高为0.421 U/mg蛋白；而25°C、0.7 mM IPTG加乙醇时，不溶级分比活力达1.012 U/mg蛋白。FTIR分析表明，37°C形成的聚集体中分子间β-折叠相对含量低于25°C，分子间相互作用较弱。进一步用1 M L-精氨酸对37°C下产生的聚集体进行非变性溶解，可溶性酰胺酶比活力较溶解前提高约329倍，效果优于GdnHCl。该工作首次证明重组酰胺酶可形成活性聚集体，并开发了温和溶解回收策略，获得的活性聚集体无需复性即可直接用作工业催化剂，为重组蛋白聚集体的资源化利用提供了新思路。
创新点
['首次报道重组铜绿假单胞菌酰胺酶可形成具有催化活性的不溶性聚集体', '利用FTIR表征不同培养条件下聚集体的分子间β-折叠含量差异', '采用L-精氨酸非变性溶解活性聚集体，比用GdnHCl能更好地恢复酶活']
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109（重组菌株pKK WT） | 酰胺代谢（酰胺水解/酰基转移） | amiE | 铜绿假单胞菌酰胺酶（acylamide amidohydrolase, EC 3.5.1.4） | 催化 | 研究其在大肠杆菌中的聚集行为、构象及L-精氨酸溶解回收 |
关键发现
- 在37°C、0.4 mM IPTG、乙醇存在时，可溶性酰胺酶比活力最高为0.421 U/mg蛋白
- 25°C、0.7 mM IPTG、乙醇条件下，不溶级分中酰胺酶比活力最高达1.012 U/mg蛋白，且在所有条件下不溶聚集体均具有生物活性。FTIR显示37°C下形成的聚集体中分子间β-折叠/α-螺旋吸收比低于25°C，且用1 M L-精氨酸溶解37°C、0.7 mM IPTG+乙醇条件下产生的聚集体，可溶性酰胺酶比活力提高约329倍。乙醇和25°C培养促进酰胺酶以活性聚集体形式高产。
研究结论
重组P. aeruginosa酰胺酶在大肠杆菌中所有 tested 条件下都以活性聚集体形式存在；37°C、0.4mM IPTG+乙醇有利于可溶性酶生产，而25°C+乙醇导致高比活的不溶性聚集体；这些聚集体可用L-精氨酸在非变性条件下温和溶解并回收，37°C聚集体因分子间相互作用较弱而更易溶解，回收酶活显著提高。该活性聚集体无需复性即可直接用作工业催化剂。