Metabolic engineering for the production of clinically important molecules: Omega-3 fatty acids, artemisinin, and taxol
- 作者
- Victor M. Ye, Sujata K. Bhatia
- 单位
- Keck School of Medicine, University of Southern California; School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University
- 杂志
- Biotechnology Journal（2011）
- DOI
- 10.1002/biot.201100289
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
omega-3脂肪酸、青蒿素和紫杉醇等临床重要分子天然来源稀缺、化学合成昂贵且不可持续，需要利用代谢工程在微生物和植物中实现经济、可持续的生产。
研究策略
分别综述三种分子的代谢工程策略：(1) 在解脂耶氏酵母和大豆等油料作物中表达去饱和酶和延长酶重构omega-3脂肪酸合成途径；(2) 在大肠杆菌和酵母中引入异源甲羟戊酸途径并优化通量，结合amorphadiene合酶等基因生产青蒿酸前体；(3) 在酵母和大肠杆菌中通过多元模块化途径工程和基因表达平衡生产紫杉醇前体紫杉二烯。
研究路线图
核心内容
该研究系统综述了运用代谢工程生产omega-3脂肪酸、青蒿素和紫杉醇三种临床重要分子的策略与进展。在omega-3脂肪酸方面，研究者在解脂耶氏酵母中引入去饱和酶与延长酶重构合成途径，使EPA含量达到油脂的40%，两阶段补料分批发酵后进一步提升至55%且饱和脂肪酸低于10%；转基因大豆表达Δ6和Δ15去饱和酶后，SDA含量达15-30%，其大豆油产品获FDA GRAS认证。在青蒿素前体合成中，大肠杆菌通过异源甲羟戊酸途径和amorphadiene合酶等策略，产量最高达27.4 g/L；酿酒酵母工程菌产量达150 mg/L，较此前提高约500倍；黄花蒿中协同表达HMGR和ADS使青蒿素含量提高7倍。紫杉醇前体紫杉二烯方面，酵母工程菌经多基因表达和合酶优化后产量达8.7 mg/L，而大肠杆菌通过多元模块化途径优化在发酵条件下达到1 g/L，比酵母高百倍以上。该工作表明，通过宿主选择、途径通量平衡、消除竞争途径和替换限速酶等策略，代谢工程能够实现这些高价值分子的经济可持续生产。
创新点
包括异源途径替换限速酶（如金黄色葡萄球菌HMG-CoA还原酶）、多拷贝基因整合、截短HMG-CoA还原酶解除负反馈调控、下调竞争途径（如鲨烯合酶、β-石竹烯合酶）、线粒体区室化表达、2A肽介导多基因共表达、以及大肠杆菌中'multivariate-modular'途径优化等。
研究对象（30）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | omega-3脂肪酸生物合成 | Δ6-desaturase | Δ6脂肪酸去饱和酶 | 催化 | Δ6途径起始酶，将LA转化为GLA、ALA转化为SDA |
| Yarrowia lipolytica | omega-3脂肪酸生物合成 | Δ5-desaturase | Δ5脂肪酸去饱和酶 | 催化 | 参与EPA合成 |
| Yarrowia lipolytica | omega-3脂肪酸生物合成 | C18/20-elongase | C18/20脂肪酸延长酶 | 催化 | 延长C18至C20 |
| Yarrowia lipolytica | omega-3脂肪酸生物合成 | C20/22-elongase (Ostreococcus tauri) | C20/22脂肪酸延长酶 | 催化 | 用于DHA合成，延长C20至C22 |
| Yarrowia lipolytica | omega-3脂肪酸生物合成 | Δ4-desaturase (Thraustochytrium aureum) | Δ4脂肪酸去饱和酶 | 催化 | 用于DHA合成 |
| Yarrowia lipolytica | omega-3脂肪酸生物合成 | Δ9-elongase | Δ9脂肪酸延长酶 | 催化 | Δ9途径起始酶 |
| 大豆 (Glycine max) | omega-3脂肪酸生物合成 | Δ6-desaturase (Primula juliae) | Δ6脂肪酸去饱和酶 | 催化 | 转基因大豆SDA含量达15-30% |
| 大豆 (Glycine max) | omega-3脂肪酸生物合成 | Δ15-desaturase (Neurospora crassa) | Δ15脂肪酸去饱和酶 | 催化 | 将LA推向ALA，增加SDA通量 |
| Escherichia coli | 青蒿素前体生物合成（异戊二烯途径） | mvaA (Staphylococcus aureus) | HMG-CoA还原酶（MvaA） | 催化 | 替换酵母HMGR，解除HMG-CoA积累瓶颈 |
| Escherichia coli | 青蒿素前体生物合成（异戊二烯途径） | mvaS (Staphylococcus aureus) | HMG-CoA合酶（MvaS） | 催化 | 与mvaA组合进一步提高amorphadiene产量 |
| Escherichia coli | 青蒿素前体生物合成 | ADS (amorphadiene synthase) | Amorphadiene合酶 | 催化 | 催化FPP环化生成amorphadiene，最高产量27.4 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素前体生物合成（甲羟戊酸途径） | tHMGR (truncated HMG-CoA reductase) | 截短HMG-CoA还原酶 | 催化 | 删除N端调控区，增加碳通量，amorphadiene产量提高5倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素前体生物合成（甾醇调控） | upc2-1 | UPC2转录因子（突变体） | 调控 | 过表达允许外源甾醇摄取，抑制内源甾醇合成，减少FPP竞争 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素前体生物合成 | CYP71AV1 | 细胞色素P450单加氧酶CYP71AV1 | 催化 | 将amorphadiene氧化为青蒿醛 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素前体生物合成 | DBR2 | 青蒿醛Δ11(13)双键还原酶 | 催化 | 将青蒿醛还原为双氢青蒿醛 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | HMGR (Catharanthus roseus) | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 转基因株系青蒿素含量增加22.5% |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | ADS | Amorphadiene合酶 | 催化 | 与HMGR共表达使青蒿素达1.73 mg/g干重，提高7倍 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | CPS (β-caryophyllene synthase) | β-石竹烯合酶 | 催化 | 反义抑制CPS使青蒿素提高54.9%，减少FPP竞争 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成 | squalene synthase (down-regulated) | 鲨烯合酶 | 催化 | 发夹RNA沉默，青蒿素达31.4 mg/g干重 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素前体生物合成 | ADS (mitochondrial-targeted) | Amorphadiene合酶 | 催化 | 线粒体区室化表达，与FPPS、tHMGR共表达，amorphadiene达6.2 mg/kg鲜重 |
| Saccharomyces cerevisiae | 紫杉醇前体生物合成 | GGPPS | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 将FPP转化为GGDP |
| Saccharomyces cerevisiae | 紫杉醇前体生物合成 | TS (taxadiene synthase) | 紫杉二烯合酶 | 催化 | 催化GGDP环化形成taxadiene，优化后产量8.7 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 紫杉醇前体生物合成 | tHMG1 | 截短HMG-CoA还原酶（Hmg1p） | 催化 | 过表达使taxadiene产量提高50% |
| Saccharomyces cerevisiae | 紫杉醇前体生物合成 | GGPPS (Sulfolobus acidocaldarius) | 香叶基香叶基焦磷酸合酶（SaGGPPS） | 催化 | 不使用FPP作为底物，减少与甾醇途径的竞争 |
| Saccharomyces cerevisiae | 紫杉醇前体生物合成 | taxadiene 5α-hydroxylase | 紫杉二烯5α-羟化酶（细胞色素P450） | 催化 | 催化taxadiene第一个氧化步骤，在酵母中表达困难 |
| Escherichia coli | 紫杉醇前体生物合成（MEP途径） | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | MEP途径限速酶，模块1基因 |
| Escherichia coli | 紫杉醇前体生物合成（MEP途径） | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 模块1基因 |
| Escherichia coli | 紫杉醇前体生物合成（MEP途径） | ispDF | 2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸胞苷酰转移酶/2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸合酶 | 催化 | 模块1基因 |
| Escherichia coli | 紫杉醇前体生物合成 | TS-GGPPS operon | 紫杉二烯合酶和香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 模块2，菌株26在发酵中taxadiene产量达1 g/L |
| Escherichia coli | 紫杉醇前体生物合成 | taxadiene 5α-hydroxylase (chimeric) | 紫杉二烯5α-羟化酶（与P450还原酶融合） | 催化 | 可转化taxadiene但产生副产物OCT，降低后续通量 |
关键发现
- 解脂耶氏酵母Y2097菌株油脂中EPA含量达40%
- 两阶段补料分批发酵后EPA含量达55%，饱和脂肪酸<10%
- DHA菌株油脂含18% DPA和6% DHA。转基因大豆表达Δ6和Δ15去饱和酶后SDA含量达15-30%，LA降至15-30%
- SDA大豆油产品含20% SDA并获FDA GRAS认证。大肠杆菌工程菌中amorphadiene产量最高达27.4 g/L
- 酿酒酵母工程菌amorphadiene产量达150 mg/L，比此前报道高约500倍。黄花蒿共表达HMGR和ADS使青蒿素含量达1.73 mg/g干重（提高7倍）
- 反义抑制β-石竹烯合酶使青蒿素提高54.9%
- 发夹RNA沉默鲨烯合酶使青蒿素达31.4 mg/g干重。本氏烟草中线粒体靶向ADS与FPPS、tHMGR共表达，amorphadiene浓度达6.2 mg/kg鲜重。酿酒酵母中表达紫杉醇前体途径5个基因后taxadiene产量仅1.0 mg/L
- 过表达tHMG1提高50%，优化taxadiene合酶后达8.7 mg/L（提高40倍）。大肠杆菌通过多元模块化工程，菌株26在发酵条件下taxadiene产量达1 g/L，比酵母高100倍以上。
研究结论
代谢工程已成功实现omega-3脂肪酸、青蒿素前体和紫杉醇前体紫杉二烯的微生物与植物合成，展示了代谢工程在满足营养和医药需求方面的经济性和可持续性潜力。宿主选择、途径通量平衡、竞争途径消除和关键酶替换是成功的关键因素。