Production of human cytochrome P450 2D6 drug metabolites with recombinant microbes - a comparative study
- 作者
- Martina Geier, Andreas Braun, Anita Emmertsoffer, Harald Pichler, Anton Glieder
- 单位
- Institute of Molecular Biotechnology, Graz University of Technology, Graz, Austria; Austrian Centre of Industrial Biotechnology (ACIB), Graz, Austria
- 杂志
- Biotechnology Journal（2012）
- DOI
- 10.1002/biot.201200187
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
评估四种微生物宿主（Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris和Yarrowia lipolytica）作为全细胞催化剂表达人细胞色素P450 2D6（CYP2D6）及其还原酶（CPR）的性能，以确定最适合生产药物代谢物的系统。
研究策略
构建共表达人CYP2D6和CPR的质粒或基因组整合表达系统，在四种宿主中表达，通过CO差光谱、Western blot、bufuralol 1'-羟化活性测定和全细胞转化实验，比较表达水平、酶活性和稳定性。
研究路线图
核心内容
该研究系统比较了四种微生物宿主——大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母和解脂耶氏酵母——作为全细胞催化剂表达人细胞色素P450 2D6（CYP2D6）及其还原酶CPR的性能。研究者构建了共表达两种蛋白的质粒或基因组整合系统，通过CO差光谱、Western blot和bufuralol羟化活性测定评估各宿主的表达水平和催化效率。结果显示，毕赤酵母菌株5x2D6/1xCPR的CYP2D6表达量达到660 pmol/mg膜蛋白，为迄今微生物系统中的最高报道值；其全细胞转化活性为9.6 mU/g CDW，另一种平衡表达CPR的菌株3x2D6/CPR则达到14.3 mU/g CDW，而大肠杆菌、酿酒酵母和解脂耶氏酵母分别为1.8、0.74和2.4 mU/g CDW。稳定性方面，毕赤酵母在6小时后保留约90%活性，48小时后仍可检测，而其他宿主在6小时内明显失活。结果表明毕赤酵母是表达CYP2D6/CPR的最佳微生物宿主，兼具高活性和优良稳定性，适用于药物代谢物的规模化生产。
创新点
首次在相同条件下比较四种微生物系统表达人CYP2D6；在P. pastoris中实现了迄今报道的最高微生物表达水平（660 pmol/mg膜蛋白），且无需N端修饰；首次实现CYP2D6和CPR由不同质粒在P. pastoris中共表达。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli LEMO21(DE3) | 药物代谢（CYP2D6介导的氧化） | CYP2D6 | 人细胞色素P450 2D6 | 催化 | 全长未修饰基因，双顺反子共表达CPR，表达量较低 |
| Escherichia coli LEMO21(DE3) | 药物代谢（CYP2D6介导的氧化） | CPR | 人NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 提供电子转移，共表达于双顺反子中 |
| Saccharomyces cerevisiae W303a | 药物代谢（CYP2D6介导的氧化） | CYP2D6 | 人细胞色素P450 2D6 | 催化 | 使用pESC-2D6-CPR共表达质粒，活性较低 |
| Saccharomyces cerevisiae W303a | 药物代谢（CYP2D6介导的氧化） | CPR | 人NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 共表达人CPR，但活性低于其他酵母 |
| Pichia pastoris CBS7435 muts | 药物代谢（CYP2D6介导的氧化） | CYP2D6 | 人细胞色素P450 2D6 | 催化 | 最高表达水平达660 pmol/mg膜蛋白（5x2D6/1xCPR菌株） |
| Pichia pastoris CBS7435 muts | 药物代谢（CYP2D6介导的氧化） | CPR | 人NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 共表达人CPR，3x2D6/CPR菌株CPR活性达2.76 U/mg膜蛋白 |
| Yarrowia lipolytica H222-S4 | 药物代谢（CYP2D6介导的氧化） | CYP2D6 | 人细胞色素P450 2D6 | 催化 | 多拷贝整合（约30拷贝），CO差光谱不可定量，但全细胞有活性 |
| Yarrowia lipolytica H222-S4 | 药物代谢（CYP2D6介导的氧化） | CPR | 人NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 共表达人CPR，CPR活性0.86 U/mg膜蛋白，全细胞稳定性最好 |
关键发现
- P. pastoris菌株5x2D6/1xCPR表达CYP2D6达660 pmol/mg总膜蛋白，为微生物系统最高
- 全细胞转化中，P.p. 5x2D6/1xCPR活性为9.6 mU/g CDW，P.p. 3x2D6/CPR为14.3 mU/g CDW，而E. coli、S. cerevisiae、Y. lipolytica分别为1.8、0.74、2.4 mU/g CDW。膜制备中，P.p. 5x2D6/1xCPR特异性活性为1.15 nmol/min/nmol，P.p. 3x2D6/CPR为3.15 nmol/min/nmol。P.p. 3x2D6/CPR的CPR活性为2.76 U/mg膜蛋白，5x2D6/1xCPR为0.33 U/mg。摇瓶培养P.p. 5x2D6/1xCPR和3x2D6/CPR分别产生77和29 nmol P450/g CDW，相当于>610 nmol CYP2D6/L培养物。温度升高使酵母全细胞活性提升约2倍（相对30°C），E. coli在30-35°C最高（约140%），50°C降至20%。稳定性方面，P.p. 3x2D6/CPR在6小时保留约90%活性，48小时后仍可检测
- S. cerevisiae在6小时后约27%，48小时完全丧失
- E. coli在6小时后几乎失活
- Y. lipolytica活性在8小时内上升且不受底物影响。
研究结论
P. pastoris是表达CYP2D6/CPR的最佳微生物宿主，全细胞活性最高且稳定性好，适用于药物代谢物生产。两种表达策略（多拷贝CYP2D6和平衡的CYP/CPR比例）可分别用于大量酶制备或高效生物催化。