Engineering the productivity of recombinant Escherichia coli for limonene formation from glycerol in minimal media
- 作者
- Christian Willrodt, Christian David, Sjef Cornelissen, Bruno Bühler, Mattijs K. Julsing, Andreas Schmid
- 单位
- Laboratory of Chemical Biotechnology, Department of Biochemical and Chemical Engineering, TU Dortmund University, Emil-Figge-Straße 66, 44227 Dortmund, Germany
- 杂志
- Biotechnology Journal（2014）
- DOI
- 10.1002/biot.201400023
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
优化重组大肠杆菌在基本培养基中以甘油或葡萄糖为碳源合成(S)-柠檬烯的效率，识别限制产量和生产力的关键参数，包括遗传、生理和反应工程因素。
研究策略
系统级优化策略：引入异源MVA途径增强前体IPP/DMAPP供应，比较不同E. coli宿主菌株，优化基因表达温度，采用两液相补料分批发酵并对比葡萄糖与甘油作为碳源的性能。
研究路线图
核心内容
该研究通过系统级优化策略，在重组大肠杆菌中实现了以甘油或葡萄糖为碳源的高效(S)-柠檬烯合成。研究者将异源甲羟戊酸途径与香叶基二磷酸合酶及(S)-柠檬烯合酶组合导入不同大肠杆菌宿主，比较了基因表达温度和碳源类型等反应工程参数。引入MVA途径后，摇瓶产量从约0.4 mg/L水相提升至15–25 mg/L，提高超过60倍。在以甘油为碳源的两液相补料分批发酵中，有机相(S)-柠檬烯浓度达到2700 mg/L，是葡萄糖碳源（690 mg/L）的3.9倍；产物得率为4.10 mg/g（葡萄糖为1.31 mg/g），空间时间产率为22.6 mg/L/h，产物对映体过量≥99.8%。结果表明，甘油相较于葡萄糖能更稳定地维持菌体比活性（最高75 mU/g cdw），且MVA途径的引入是大幅提升产量的关键，而内源FPP合酶竞争是限制进一步增产的重要因素。该研究首次在基本培养基中实现生长依赖的单萜生产，并获得当时报道的最高微生物单萜浓度，为后续优化乙酰-CoA通量与能量供给指明了方向。
创新点
首次在基本培养基中实现生长依赖的(S)-柠檬烯生产；以甘油为碳源的两液相补料分批发酵获得目前报道的最高微生物单萜浓度（2.7 g/L有机相）；系统阐明了MVA途径、内源FPP合酶竞争和反应工程对产量的影响。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 异源MVA途径 | atoB | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，催化乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 异源MVA途径 | ERG13 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶 | 催化 | 来自酿酒酵母 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 异源MVA途径 | tHMGR | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，截短形式以改善表达 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 异源MVA途径 | ERG12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自酿酒酵母 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 异源MVA途径 | ERG8 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 来自酿酒酵母 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 异源MVA途径 | ERG19 | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 | 催化 | 来自酿酒酵母 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 异源MVA途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，催化IPP与DMAPP互变 |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 单萜合成途径 | AGPPS2 | 香叶基二磷酸合酶2 | 催化 | 来自大冷杉（Abies grandis），催化IPP和DMAPP生成GPP |
| Escherichia coli BL21 (DE3) | 单萜合成途径 | LS | (S)-柠檬烯合酶 | 催化 | 来自留兰香（Mentha spicata），催化GPP环化生成(S)-柠檬烯 |
| Escherichia coli W3110 SF7N | 内源类异戊二烯途径 | ispA | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 编码FPP合酶，SF7N中敲除，与野生型SF5比较，结果显示不影响柠檬烯产量 |
| Escherichia coli MG1655 (Δpta) | 乙酸形成途径 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 敲除此基因以减少乙酸形成，但未提高柠檬烯产量 |
关键发现
- 以甘油为碳源的两液相补料分批发酵中，(S)-柠檬烯最终浓度达到2700 mg/L有机相，是葡萄糖（690 mg/L有机相）的3.9倍
- 比活性在甘油条件下稳定在≥50 mU/g细胞干重（cdw），最高达75 mU/g cdw
- 葡萄糖和甘油为碳源时的产物得率分别为1.31 mg/g和4.10 mg/g，为理论最大值的0.45%和1.0%
- 空间时间产率分别为5.6和22.6 mg/L/h。引入MVA途径后，摇瓶产量从约0.4 mg/L水相提高到15-25 mg/L水相（超过60倍）。纯化后(S)-柠檬烯对映体过量≥99.8%，纯度≥96%。
研究结论
通过系统优化（代谢工程、宿主选择和反应工程）显著提高了重组大肠杆菌生产(S)-柠檬烯的效率，以甘油为碳源获得了目前最高的微生物单萜浓度。未来改进应聚焦于优化乙酰-CoA通量、能量及还原当量供给，并进一步解耦细胞生长与产物合成。