Tools of pathway reconstruction and production of economically relevant plant secondary metabolites in recombinant microorganisms
- 作者
- Clarissa Dziggel, Holger Schäfer, Michael Wink
- 单位
- 德国海德堡大学，药学与分子生物技术研究所
- 杂志
- Biotechnology Journal（2017）
- DOI
- 10.1002/biot.201600145
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物次生代谢产物在植物中含量低、提取困难，难以满足市场需求，需要在微生物宿主中重构其生物合成途径。
研究策略
综述了利用合成生物学工具（如模块化代谢工程、蛋白质工程、CRISPR-Cas9/dCas9、共培养系统等）在微生物中重构萜类、生物碱和苯丙烷类植物次生代谢产物的生物合成途径，并总结了从植物中鉴定和克隆基因的技术（如转录组学、VIGS）。
研究路线图
核心内容
该文系统综述了利用合成生物学工具在微生物宿主中重构植物次生代谢产物生物合成途径的研究进展。作者围绕萜类、生物碱和苯丙烷类三大类化合物，梳理了模块化代谢工程、蛋白质工程、CRISPR-Cas9/dCas9转录调控、人工蛋白融合与支架以及共培养系统等策略的应用，并介绍了转录组学、病毒诱导基因沉默（VIGS）等用于鉴定和克隆植物来源基因的技术。文中列举了多个完整通路重构的典型案例，例如青蒿酸在酵母中最高产量达25 g/L，紫杉二烯在大肠杆菌中达1 g/L；苯丙烷类中柚皮素产量达421 mg/L，而生物碱类中(S)-网状番荔枝碱从甘油从头合成产量为46.0 mg/L，蒂巴因在大肠杆菌中达2.1 mg/L但在酵母中仅6.4 μg/L，凸显了宿主选择对产量的显著影响。综述表明，尽管许多植物次生代谢途径尚未完全解析，但组学数据、基因沉默和CRISPR等工具加速了基因功能鉴定，结合微生物代谢工程优化，已能实现若干高价值天然产物的从头合成，未来有望进一步扩大可生产化合物的范围和提升产量。
创新点
系统归纳了新一代测序、基因沉默（VIGS）、CRISPR-dCas9转录调控、人工蛋白融合与支架、模块化共培养等新技术在植物次生代谢物微生物合成中的应用，并列举了多个完整通路重构的成功实例。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素生物合成 | ADS | amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化FPP环化生成amorpha-4,11-diene |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素生物合成 | CYP71AV1 | cytochrome P450 monooxygenase | 催化 | 氧化amorpha-4,11-diene生成青蒿醇/青蒿醛 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素生物合成 | CPR1 | cytochrome P450 reductase | 催化 | CYP71AV1的氧化还原伴侣蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素生物合成 | CYB5 | cytochrome b5 | 催化 | 促进青蒿酸合成，但过量会导致醛积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素生物合成 | ADH1 | alcohol dehydrogenase | 催化 | 与ALDH1共同减少青蒿醛积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素生物合成 | ALDH1 | aldehyde dehydrogenase | 催化 | 将青蒿醛氧化为青蒿酸，提高产量 |
| Escherichia coli | 紫杉醇生物合成 | TXS | taxadiene synthase | 催化 | 催化GGPP环化生成taxadiene |
| Escherichia coli | 紫杉醇生物合成 | CYP725A4 | taxoid 5α-hydroxylase | 催化 | 催化taxadiene C5位羟基化，但异源表达困难 |
| Saccharomyces cerevisiae | 单萜吲哚生物碱生物合成 | G8H | geraniol 8-hydroxylase | 催化 | strictosidine合成途径的关键瓶颈酶，需额外拷贝 |
| Saccharomyces cerevisiae | 单萜吲哚生物碱生物合成 | STR | strictosidine synthase | 催化 | 催化secologanin与tryptamine缩合生成strictosidine |
| Escherichia coli | 苄基异喹啉生物碱生物合成 | SalSyn | salutaridine synthase | 催化 | CYP酶，催化(R)-reticuline转化为salutaridine，需N端修饰 |
| Escherichia coli | 苄基异喹啉生物碱生物合成 | SalR | salutaridine reductase | 催化 | 催化salutaridine还原为salutaridinol |
| Escherichia coli | 苄基异喹啉生物碱生物合成 | SalAT | salutaridinol acetyltransferase | 催化 | 催化salutaridinol乙酰化生成thebaine前体 |
| Escherichia coli | 苄基异喹啉生物碱生物合成 | STORR | cytochrome P450-oxidoreductase fusion protein (DRS-DRR/REPI) | 催化 | 催化(S)-reticuline异构化为(R)-reticuline，在E. coli中活性低 |
| Escherichia coli | 苯丙烷类生物合成 | CHS | chalcone synthase | 催化 | 催化p-coumaroyl-CoA与malonyl-CoA缩合生成查尔酮 |
| Escherichia coli | 苯丙烷类生物合成 | STS | stilbene synthase | 催化 | 催化白藜芦醇合成 |
| Escherichia coli | 黄酮生物合成 | dCas9 | CRISPR-dCas9 | 调控 | 通过转录干扰下调内源基因，提高malonyl-CoA供给，用于naringenin生产 |
关键发现
- 青蒿酸在酵母中最高产量达25 g/L（Paddon 2013）；紫杉二烯在大肠杆菌中产量达1 g/L，taxadiene-5α-ol达58 mg/L（Ajikumar 2010）；strictosidine在酵母中产量达0.5 mg/L（Brown 2015）。(S)-retculine在大肠杆菌中从甘油从头合成产量达46.0 mg/L（Nakagawa 2011）；thebaine在大肠杆菌中达2.1 mg/L，而酵母中仅6.4 μg/L（Nakagawa 2016; Galanie 2015）。naringenin在大肠杆菌中产量达421 mg/L（Wu 2015）；eriodyctiol从葡萄糖合成5 mg/L、从酪氨酸合成107 mg/L；kaempferol 3-O-rhamnoside 57 mg/L；ponciretin
- 5 mg/L；sakuranetin
- 1 mg/L；raspberry ketone在酵母中达2.8 mg/L（Lee 2016）。共培养系统中magnoflorine
- 2 mg/L、scoulerine
- 3 mg/L；酵母中(R,S)-reticuline从norlaudanosoline合成达150 mg/L，noscapine
- 6 mg/L，sanguinarine 80 μg/L。
研究结论
尽管许多植物次生代谢途径尚未完全解析，但组学数据、基因沉默和CRISPR等工具加速了基因功能鉴定，结合微生物代谢工程的不断优化，已能实现某些高价值天然产物（如青蒿酸、吗啡前体、类黄酮等）的从头合成，未来有望扩大可生产化合物的范围并提高产量。