Over-expression of ICE2 stabilizes cytochrome P450 reductase in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris
- 作者
- Anita Emmerstorfer, Miriam Wimmer-Teubenbacher, Tamara Wriessnegger, Erich Leitner, Monika Müller, Iwona Kaluzna, Martin Schürmann, Daniel Mink, Günther Zellnig, Helmut Schwab, Harald Pichler
- 单位
- ACIB- Austrian Centre of Industrial Biotechnology, Graz, Austria; Institute of Molecular Biotechnology, Graz University of Technology, NAWI Graz, Graz, Austria; Institute of Analytical Chemistry and Food Chemistry, Graz University of Technology, NAWI Graz, Graz, Austria; DSM Innovative Synthesis B.V., Geleen, The Netherlands; Institute of Plant Sciences, University of Graz, NAWI Graz, Graz, Austria
- 杂志
- Biotechnology Journal（2015）
- DOI
- 10.1002/biot.201400780
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
膜锚定细胞色素P450酶(CYPs)在工业应用中需要足够的细胞色素P450还原酶(CPR)活性来再生催化能力，而CPR不稳定是许多应用的瓶颈。
研究策略
通过筛选酿酒酵母基因敲除库，鉴定影响HPO/AtCPR功能的因子，发现ICE2缺失导致AtCPR不稳定；进一步在两种酵母中过表达ICE2，验证其对多种CYP/CPR组合的稳定化作用，并通过静息细胞转化和体内生物转化评估效果。
研究路线图
核心内容
该研究针对细胞色素P450酶（CYP）在酵母工业应用中因还原酶（CPR）不稳定而受限的瓶颈问题，通过筛选酿酒酵母基因敲除库，鉴定出ICE2基因缺失会导致CPR失稳，进而提出过表达ICE2以稳定CPR的策略。研究在酿酒酵母W303和毕赤酵母两种宿主中，对多种CYP/CPR组合进行了验证。结果显示，过表达ICE2可显著提升CPR蛋白水平与活性：在酿酒酵母中，24小时时对照菌株CPR活性几乎检测不到，而过表达菌株保留约50%活性；静息细胞转化(+)-valencene生成trans-nootkatol的效率提高1.4倍；体内转化实验中，trans-nootkatol产量由约16 mg/L提高至22 mg/L，72小时最高达30 mg/L。此外，ICE2过表达使bufuralol羟化效率在酿酒酵母中提高1.5倍、毕赤酵母中提高2.5倍，且毕赤酵母中(-)-limonene转化仅在共表达PpICE2时得以实现。该研究首次证实ICE2过表达可作为稳定重组CPR、提升CYP催化效率的通用策略，为酵母中CYP酶的应用提供了简便有效的工程手段。
创新点
首次发现并验证ICE2过表达能够稳定重组细胞色素P450还原酶(CPR)，提高CYP介导的生物转化效率；该效应在多种CYP/CPR组合及酿酒酵母和毕赤酵母两种宿主中均成立，提出ICE2上调作为酵母中重组CYP应用的通用策略。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae W303 | 萜类生物合成（(+)-valencene羟基化） | HPO (CYP71D55 variant V482I A484I) | HPO | 催化 | 催化(+)-valencene羟基化生成trans-nootkatol |
| Saccharomyces cerevisiae W303 | 萜类生物合成（(+)-valencene羟基化） | AtCPR | AtCPR | 催化 | 细胞色素P450还原酶，为HPO提供电子 |
| Saccharomyces cerevisiae W303 | 萜类生物合成 | ICE2 | Ice2p | 调控 | 内质网III型膜蛋白，过表达稳定AtCPR水平与活性 |
| Saccharomyces cerevisiae W303 | 萜类生物合成 | ValS | ValS（(+)-valencene synthase） | 催化 | 来自Callitropsis nootkatensis，合成(+)-valencene |
| Saccharomyces cerevisiae W303 | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达增强萜类前体FPP供应 |
| Saccharomyces cerevisiae W303 | 单萜代谢 | PM17 | PM17（(-)-limonene-3-hydroxylase） | 催化 | 来自Mentha piperita，催化(-)-limonene羟基化 |
| Saccharomyces cerevisiae W303 | 药物代谢 | CYP2D6 | CYP2D6 | 催化 | 人类细胞色素P450 2D6 |
| Saccharomyces cerevisiae W303 | 药物代谢 | hCPR | hCPR | 催化 | 人类细胞色素P450还原酶 |
| Pichia pastoris | 萜类生物合成 | PpICE2 | PpIce2p | 调控 | 毕赤酵母同源ICE2，过表达同样稳定CPR |
关键发现
- 在W303背景中，ICE2过表达使静息细胞中(+)-valencene羟基化生成trans-nootkatol提高1.4倍（p<0.01）
- 在体内生产(+)-valencene并转化的菌株中，ICE2过表达使trans-nootkatol产量提高约40%，达到22 mg/L（对照约16 mg/L），72小时后最高达30 mg/L
- ICE2过表达使CPR蛋白水平和活性在72小时内保持稳定，24小时时对照菌株CPR活性几乎检测不到而过表达菌株保留约50%活性
- 在S. cerevisiae中，ICE2过表达后3种CYP/CPR组合的CPR活性在6小时提高1.17-1.41倍，24小时提高2.94-3.73倍
- 在P. pastoris中48小时提高1.31-1.42倍
- bufuralol羟化在S. cerevisiae中提高1.5倍，在P. pastoris中提高2.5倍
- 在P. pastoris中，(-)-limonene转化仅在共表达PpICE2时检测到。
研究结论
ICE2过表达可稳定酵母中的重组细胞色素P450还原酶，提高CYP催化的生物转化效率，可作为改善酵母重组CYP应用的通用工具。