(+)-Valencene production in Nicotiana benthamiana is increased by down-regulation of competing pathways
- 作者
- Katarina Cankar, Esmer Jongedijk, Martin Klompmaker, Timotej Majdic, Roland Mumm, Harro Bouwmeester, Dirk Bosch, Jules Beekwilder
- 单位
- Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University and Research Centre, Wageningen, The Netherlands; Plant Research International, Business Unit Bioscience, Wageningen University and Research Centre, Wageningen, The Netherlands
- 杂志
- Biotechnology Journal（2015）
- DOI
- 10.1002/biot.201400288
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物中异源表达倍半萜合酶（如(+)-缬草烯合成酶）产量低，原因是内源竞争途径（如5-epi-aristolochene合成和甾醇/三萜合成）与异源途径争夺共同前体法尼基焦磷酸（FPP）。
研究策略
在本氏烟草中通过农杆菌浸润瞬时表达(+)-缬草烯合成酶（CnVS），同时利用RNAi沉默内源竞争FPP的两个关键酶——5-epi-aristolochene合酶（EAS）和角鲨烯合酶（SQS），并过表达FPP生物合成中的限速酶截短型HMG-CoA还原酶（tHMGR）和法尼基焦磷酸合酶（FPS），以提高(+)-缬草烯产量。
研究路线图
核心内容
本研究以本氏烟草为底盘，通过农杆菌瞬时共表达来自努特卡扁柏的(+)-缬草烯合成酶，并采用RNAi分别或同时沉默内源竞争途径的关键酶5-epi-aristolochene合酶和角鲨烯合酶，另设过表达截短型HMG-CoA还原酶与法尼基焦磷酸合酶的组合，以评估各策略对倍半萜积累的影响。结果表明，单独表达合成酶时(+)-缬草烯产量仅0.70微克每克叶片每24小时；沉默角鲨烯合酶使产量提升2.8倍，同时沉默两条竞争途径使产量提升2.7倍，且(+)-缬草烯成为主要挥发性产物。过表达前体供应基因使产量提升2.9倍，但伴随副产物5-epi-aristolochene排放增加37倍；将该策略与沉默组合未进一步提高目标产量，反而出现法尼醇排放。上述结果说明，RNAi削弱内源FPP竞争途径能有效提高异源倍半萜积累，而当前产量受限于合成酶催化活性或表达水平，而非前体供应，提示后续优化应着力于酶活增强。
创新点
首次在植物中采用RNAi策略沉默内源竞争途径来提高倍半萜产量；利用瞬时表达系统快速评估多种基因组合对目标产物积累的影响。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana benthamiana | 甲羟戊酸途径/倍半萜合成 | CnVS | (+)-valencene synthase (from Callitropsis nootkatensis) | 催化 | 异源表达的(+)-缬草烯合酶，催化FPP生成(+)-缬草烯 |
| Nicotiana benthamiana | 倍半萜合成 | EAS | 5-epi-aristolochene synthase | 催化 | 内源竞争FPP的酶，生成5-epi-aristolochene，通过RNAi沉默 |
| Nicotiana benthamiana | 甾醇/三萜合成 | SQS | squalene synthase | 催化 | 内源竞争FPP的酶，催化FPP生成角鲨烯，通过RNAi沉默 |
| Nicotiana benthamiana | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (from Arabidopsis thaliana) | 催化 | 截短型HMG-CoA还原酶，过表达以增强FPP前体供应 |
| Nicotiana benthamiana | 甲羟戊酸途径 | FPS2 | farnesyl diphosphate synthase (from Arabidopsis thaliana) | 催化 | 过表达以增强FPP合成 |
关键发现
- 单独表达CnVS时(+)-缬草烯产量为0.70±0.13 μg/g leaf/24h
- 沉默EAS（EasRNAi1）使EAS转录水平降低3.4倍、5-epi-aristolochene排放降低8.4倍
- 沉默SQS（SqsRNAi2）使SQS转录降低4.2倍，(+)-缬草烯产量提高2.8倍
- 同时沉默EAS和SQS使(+)-缬草烯产量提高2.7倍，且(+)-缬草烯成为主要挥发物
- 过表达tHMGR和FPS使(+)-缬草烯产量提高2.9倍，但5-epi-aristolochene排放增加37倍
- 将过表达与沉默策略结合未进一步提高(+)-缬草烯产量，但出现了新的法尼醇排放峰。
研究结论
RNAi沉默内源竞争FPP的途径可有效提高植物中异源倍半萜的产量，使(+)-缬草烯成为主要挥发物。当FPP供应不再限制时，法尼醇的生成表明(+)-缬草烯产量受限于CnVS的催化活性或表达水平，进一步改进需提高CnVS活性或蛋白量。