Dual utilization of NADPH and NADH cofactors enhances xylitol production in engineered Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Jung-Hyun Jo, Sun-Young Oh, Hyeun-Soo Lee, Yong-Cheol Park, Jin-Ho Seo
- 单位
- Department of Agricultural Biotechnology and Center for Food and Bioconvergence, Seoul National University, Seoul, Republic of Korea; Department of Bio and Fermentation Convergence Technology, Kookmin University, Seoul, Republic of Korea
- 杂志
- Biotechnology Journal（2015）
- DOI
- 10.1002/biot.201500068
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
微生物木糖醇生产仅依赖NADPH辅因子，导致辅因子供应不足，限制木糖醇生物合成的商业化。
研究策略
在酿酒酵母中同时表达依赖NADPH的野生型木糖还原酶（wXR）和偏好NADH的突变型木糖还原酶（mXR），并过表达ZWF1（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）和ACS1（乙酰辅酶A合成酶）以再生NADPH和NADH，结合优化的葡萄糖限制补料分批发酵和木糖补料策略。
研究路线图
核心内容
该研究针对酿酒酵母木糖醇生产过度依赖NADPH导致辅因子供应不足的问题，首次在菌株中同时表达依赖NADPH的野生型木糖还原酶（wXR）和偏好NADH的突变型木糖还原酶（mXR），并过表达ZWF1与ACS1以分别强化NADPH和NADH的再生。批次发酵中，双酶菌株DWM的木糖醇浓度较仅表达NADPH依赖型XR的菌株提高6.6%，较仅表达NADH偏好型XR的菌株提高47%；在补料分批发酵中，DWM的木糖醇浓度和生产力分别比对照提高13%和14%。单独过表达ZWF1或ACS1使最大生产力达到2.04和2.15 g/L/h，共表达两者的菌株DWM-ZWF1-ACS1进一步将生产率提升至2.33 g/L/h。结合间歇补加木糖策略获得185.3 g/L木糖醇，而连续补加木糖策略最终实现196.2 g/L木糖醇和4.27 g/L·h的生产力，产率接近理论值（~1 g/g）。该策略通过双辅因子协同利用与再生，显著解除了辅因子限制，使木糖醇生产达到工业化水平。
创新点
首次在酿酒酵母中同时表达两种辅因子特异性的木糖还原酶，实现NADPH和NADH的双重利用；协同过表达NADPH和NADH再生酶（ZWF1和ACS1）；通过连续补糖和木糖补料策略大幅提高木糖醇产量和生产力。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 木糖还原途径 | XYL1 (wild-type) | 野生型木糖还原酶 (wXR) | 催化 | 来自Scheffersomyces stipitis，依赖NADPH催化木糖转化为木糖醇 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 木糖还原途径 | XYL1 (mutant) | 突变型木糖还原酶 (mXR) | 催化 | 来自Scheffersomyces stipitis，偏好NADH催化木糖转化为木糖醇 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 磷酸戊糖途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 (Zwf1p) | 催化 | 催化葡萄糖-6-磷酸氧化，生成NADPH，用于NADPH再生 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 乙酰辅酶A代谢/TCA循环 | ACS1 | 乙酰辅酶A合成酶 (Acs1p) | 催化 | 催化乙酸转化为乙酰辅酶A，间接促进NADH和NADPH再生 |
关键发现
- 批次发酵中，同时表达两种XR的DWM菌株比仅表达NADPH依赖型XR的DWW菌株木糖醇浓度提高6.6%，比仅表达NADH偏好型XR的DMM菌株提高47%
- 葡萄糖限制补料分批发酵中，DWM菌株比DWW菌株木糖醇浓度提高13%，生产力提高14%
- 在DWM中单独过表达ZWF1或ACS1使最大木糖醇生产力分别达2.04和2.15 g/L/h，比对照高4-15%
- 共表达ZWF1和ACS1的DWM-ZWF1-ACS1菌株木糖醇生产率达2.33 g/L/h，比DWM-C提高17%
- 采用间歇补加木糖策略使DWM-ZWF1-ACS1产生185.3 g/L木糖醇，生产力3.71 g/L/h
- 采用连续补加木糖策略最终获得196.2 g/L木糖醇，生产力4.27 g/L·h，木糖醇产率接近理论值（~1 g/g）
- DWM-ZWF1-ACS1菌株的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和乙酰辅酶A合成酶比活比对照高至少5倍。
研究结论
通过同时表达利用NADPH和NADH的木糖还原酶，并过表达ZWF1和ACS1增强辅因子再生，显著提高了酿酒酵母的木糖醇产量和生产效率，最终获得196.2 g/L木糖醇和4.27 g/L·h生产力，接近理论产率，满足工业化需求。