Farnesol production in Escherichia coli through the construction of a farnesol biosynthesis pathway - application of PgpB and YbjG phosphatases
- 作者
- Chonglong Wang, Ju-Eon Park, Eui-Sung Choi, Seon-Won Kim
- 单位
- Division of Applied Life Science (BK21 Plus), PMBBRC, Gyeongsang National University, Jinju, Republic of Korea; School of Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou, People's Republic of China; Industrial Biotechnology Research Center, KRIBB, Daejeon, Republic of Korea
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2017）
- DOI
- 10.1002/bit.201600250
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中构建法尼醇生物合成途径，需要鉴定能够将法尼基焦磷酸(FPP)水解为法尼醇的内源磷酸酶。
研究策略
利用FPP积累时上调的磷酸酶候选基因，与FPP合酶编码基因ispA组成双基因操纵子，在外源甲羟戊酸途径供给IPP/DMAPP的条件下进行筛选；通过基因敲除和定点突变验证PgpB和YbjG的FPP水解活性。
研究路线图
核心内容
本研究在大肠杆菌中开发了一条新型法尼醇生物合成途径。作者利用法尼基焦磷酸（FPP）积累时上调的候选磷酸酶基因，与FPP合酶基因ispA构建双基因操纵子，并在外源甲羟戊酸途径供给IPP/DMAPP的条件下进行筛选，首次鉴定出内膜磷酸酶PgpB和YbjG具有将FPP水解为法尼醇的兼职功能。通过基因敲除和定点突变验证，PgpB的His207和YbjG的His145保守残基对FPP水解活性至关重要，双敲除pgpB和ybjG使法尼醇产量降至参考水平的13.8%。过表达ispA-pgpB操纵子与MVA途径后，法尼醇产量达到526.1 mg/L，是参考菌株（74.3 mg/L）的7.1倍，也是酿酒酵母长期发酵产量（145.7 mg/L）的3.6倍；过表达ispA-ybjG的产量为154 mg/L，提高2.1倍。该研究证实内源磷酸酶的兼职FPP水解功能可有效用于构建大肠杆菌法尼醇合成途径，为法尼醇的微生物生产提供了新策略。
创新点
首次发现大肠杆菌内膜磷酸酶PgpB和YbjG具有将FPP水解为法尼醇的兼职功能，并利用其构建新型法尼醇合成途径，实现高产。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | — | — | — | — | 宿主菌株，用于法尼醇生产与突变验证 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸(MVA)途径 | mvaE, mvaS, mvaK1, mvaK2, mvaD, idi | MvaE, MvaS, MvaK1, MvaK2, MvaD, IDI | 催化 | 外源MVA途径，合成IPP和DMAPP为FPP提供前体 |
| Escherichia coli DH5α | FPP合成 | ispA | IspA | 催化 | FPP合酶，催化IPP与DMAPP缩合生成FPP |
| Escherichia coli DH5α | FPP水解 | pgpB | PgpB | 催化 | 膜整合磷酸酶，水解FPP生成法尼醇，关键残基His207 |
| Escherichia coli DH5α | FPP水解 | ybjG | YbjG | 催化 | 膜整合磷酸酶，水解FPP生成法尼醇，关键残基His145 |
| Escherichia coli DH5α | FPP水解 | bacA, yeiU, pgpA, pgpC | BacA, YeiU, PgpA, PgpC | 催化 | 其他测试的相关磷酸酶，未显著提高法尼醇产量 |
| Escherichia coli DH5α | FPP水解 | pgpB同源基因 (Ea, Kp, Pa, Se), ybjG同源基因 (Ea, Kp, Pa, Se) | PgpB和YbjG同源蛋白 | 催化 | 来自Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumonia, Pantoea ananatis, Salmonella enterica的PgpB/YbjG同源磷酸酶均具有FPP水解活性 |
关键发现
- 过表达ispA-pgpB操纵子与MVA途径后，大肠杆菌法尼醇产量达526.1 mg/L，是参考菌株(74.3 mg/L)的7.1倍
- 过表达ispA-ybjG产量为154 mg/L，提高2.1倍。初筛中，过表达ispA-pgpB和ispA-ybjG分别使法尼醇合成能力提高6.3倍和3.3倍。敲除pgpB或ybjG分别使法尼醇产量降至参考水平的34.5%和25.4%，双敲除降至13.8%。PgpB的His207和YbjG的His145保守残基对其FPP水解活性至关重要。该产量是酿酒酵母长期发酵产量(145.7 mg/L)的3.6倍。
研究结论
研究证实内源磷酸酶PgpB和YbjG的兼职FPP水解功能可用于构建大肠杆菌法尼醇合成途径，产量优于酿酒酵母长期发酵，为法尼醇的微生物生产提供了新策略。