Genome analysis of a hyper acetone-butanol-ethanol (ABE) producing Clostridium acetobutylicum BKM19
- 作者
- Changhee Cho, Donghui Choe, Yu-Sin Jang, Kyung-Jin Kim, Won Jun Kim, Byung-Kwan Cho, E. Terry Papoutsakis, George N. Bennett, Do Young Seung, Sang Yup Lee
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering (BK21 Plus Program), BioProcess Engineering Research Center, Center for Systems and Synthetic Biotechnology, Institute for the BioCentury, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), Daejeon, Republic of Korea; Department of Biological Sciences and KI for the BioCentury, KAIST, Daejeon, Republic of Korea; Department of Agricultural Chemistry and Food Science, Gyeongsang National University, Jinju, Gyeongsangnam-do, Republic of Korea; School of Life Sciences, KNU Creative BioResearch Group, Kyungpook National University, Daegu, Korea; Intelligent Synthetic Biology Center, KAIST, Daejeon, Republic of Korea; Department of Chemical Engineering and Delaware Biotechnology Institute, University of Delaware, Newark, Delaware, USA; Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University, Houston, Texas, USA; GS Caltex Corporation R&D Center, Daejeon, Republic of Korea
- 杂志
- Biotechnology Journal（2017）
- DOI
- 10.1002/biot.201600457
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析超高产ABE的Clostridium acetobutylicum BKM19菌株基因组突变，找出导致溶剂产量提高的关键遗传变异，特别是与丁醇合成相关的突变。
研究策略
通过对BKM19及其亲本菌株PJC4BK进行高通量测序和比较基因组分析，鉴定单核苷酸变异（SNVs）和插入缺失（InDels），重点对硫解酶基因thlA的突变进行功能验证，包括酶活性测定、过表达工程菌株发酵实验和蛋白质结构分析。
研究路线图
核心内容
本研究对超高产丙酮-丁醇-乙醇（ABE）的丙酮丁醇梭菌BKM19菌株及其亲本PJC4BK进行了高通量测序与比较基因组分析，共鉴定出13个单核苷酸变异、1个缺失和1个回复突变，其中仅1个SNV位于巨质粒，其余均在染色体上。关键发现是硫解酶基因thlA的V5A突变：体外酶活测定显示突变型ThlA活性达815.2 U/mg，较野生型617.4 U/mg提高32%。在野生型ATCC 824中过表达thlA V5A使丁醇产量达6.1 g/L（产率0.14 g/g葡萄糖），显著高于过表达野生型thlA的4.5 g/L（0.11 g/g）；在thlA敲低菌株和BKM19中过表达同样验证了该突变对丁醇合成的促进作用。最终BKM19在分批发酵中可从85.2 g/L葡萄糖生产32.5 g/L ABE。蛋白结构分析提示V5A突变虽远离活性位点，但可能通过影响调节性决定区的稳定性来增强酶功能。该工作首次系统解析了BKM19的突变谱，证明thlA V5A是提升丁醇碳通量的关键遗传因素，为梭菌溶剂发酵的理性改造提供了新靶点，其余突变的协同作用仍需后续研究。
创新点
首次报道BKM19菌株的基因组突变谱，发现thlA V5A突变显著提高硫解酶活性并促进丁醇合成，并通过结构分析揭示该突变远离活性位点但可能影响调节性决定区（RDR）稳定性。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Clostridium acetobutylicum BKM19 | 丁酸/丁醇发酵途径 | thlA | 硫解酶 (ThlA V5A) | 催化 | 第5位缬氨酸突变为丙氨酸，酶活性提高32%，促进丁醇合成 |
| Clostridium acetobutylicum ATCC 824 | 丁酸/丁醇发酵途径 | thlA | 野生型硫解酶 (ThlA) | 催化 | 过表达野生型thlA作为对照，丁醇产量4.5 g/L |
| Clostridium acetobutylicum TKW-A | 丁酸/丁醇发酵途径 | thlA | 硫解酶 (敲低) | 催化 | thlA敲低菌株，用于验证突变基因过表达效果 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 无（异源蛋白表达） | thlA | 重组硫解酶 | 催化 | 用于表达和纯化野生型及突变型硫解酶，测定酶活性 |
关键发现
- BKM19与亲本菌株PJC4BK相比，共鉴定出13个SNVs、1个缺失和1个回复突变SNV
- 除1个SNV位于巨质粒外，其余均位于染色体上。突变型硫解酶ThlA V5A活性为815.2 U/mg，比野生型ThlA (617.4 U/mg)提高32%。在野生型ATCC 824中过表达thlA V5A，丁醇产量达6.1 g/L（产率0.14 g/g葡萄糖），而过表达野生型thlA的对照组为4.5 g/L（产率0.11 g/g）。在thlA敲低菌株TKW-A中过表达thlA V5A，丁醇产量为5.8 g/L（产率0.13 g/g），对照组为4.0 g/L（产率0.07 g/g）。在BKM19菌株中过表达thlA V5A，丁醇产量为15.0 g/L（产率0.20 g/g），过表达野生型thlA为13.5 g/L（产率0.18 g/g）。BKM19菌株在分批发酵中可从85.2 g/L葡萄糖生产32.5 g/L ABE（丁醇17.6、乙醇10.5、丙酮4.4 g/L）。与参考基因组ATCC 824相比，PJC4BK菌株含有155个SNVs、6个MNVs和29个InDels。
研究结论
BKM19菌株的基因组突变中，thlA V5A突变是增强丁醇生产的关键因素之一，通过提高硫解酶活性增加碳通量流向丁醇途径；其他突变的作用需进一步研究。