Methods for suspension culture, protoplast extraction, and transformation of high-biomass yielding perennial grass Arundo donax
- 作者
- Gaia Pigna, Taniya Dhillon, Elizabeth M. Dlugosz, Joshua S. Yuan, Connor Gorman, Piero Morandini, Scott C. Lenaghan, C. Neal Stewart, Jr.
- 单位
- Department of Plant Sciences, University of Tennessee, Knoxville, USA; Department of Biosciences, University of Milan, Milano, Italy; National Research Council, Institute of Biophysics, Milano, Italy; Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University, College Station, TX, USA; Department of Food Science, University of Tennessee, Knoxville, USA; Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, Knoxville, USA
- 杂志
- Biotechnology Journal（2017）
- DOI
- 10.1002/biot.201600486
- 所属领域
- 植物生物技术
- 关键词
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解决的核心问题
Arundo donax组织培养和遗传转化困难，缺乏快速高效的原生质体瞬时转化体系，限制其作为生物能源作物的遗传改良。
研究策略
通过比较不同培养基建立悬浮细胞系，优化原生质体分离条件，并采用电穿孔实现瞬时转化，利用双荧光报告载体比较单子叶和双子叶启动子活性。
研究路线图
核心内容
该研究针对高生物量多年生禾本科能源植物芦竹（Arundo donax）组织培养与遗传转化困难的问题，建立了高效的悬浮培养、原生质体提取及电穿孔瞬时转化体系。研究者比较了不同培养基，发现DBAP液体培养基（含9μM 2,4-D和4.4μM BAP）培养14天使组织鲜重增加5倍，显著优于CIM培养基的1.4倍；优化悬浮培养21天内最大组织鲜重达起始的4.7倍。从悬浮细胞中分离原生质体，得率达3.8×10^5±2.5×10^5个/ml PCV，平均直径20.7±12.3μm。电穿孔转化（130V, 1000μF）效率为3.3±1.5%，而提高电压至300V虽存活率从67.7%降至11.9%且无转化，PEG介导转化未能成功。通过双荧光报告载体比较启动子活性，发现柳枝稷PvUbi2启动子在芦竹原生质体中驱动报告基因表达明显强于CaMV 35S启动子。该研究为芦竹的遗传改良提供了重要工具，并证明PvUbi2是适用于该物种的强启动子，对生物能源作物载体设计具有指导意义。
创新点
建立了DBAP液体悬浮培养体系，使组织产量显著提高；开发了低成本、高效的原生质体分离和电穿孔转化方法；构建了pTD-PvUbi2-35S双荧光报告载体，用于在Arundo中直接比较启动子强度。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Arundo donax | 启动子活性比较 | PvUbi2 | — | 调控 | 柳枝稷polyubiquitin 2启动子，在Arundo原生质体中驱动pporRFP强表达 |
| Arundo donax | 启动子活性比较 | CaMV 35S | — | 调控 | 花椰菜花叶病毒35S启动子，驱动mGFP5-ER表达较弱 |
| Arundo donax | 荧光蛋白表达 | pporRFP | pporRFP | 催化 | 橙色荧光蛋白报告基因 |
| Arundo donax | 荧光蛋白表达 | mGFP5-ER | mGFP5-ER | 催化 | 绿色荧光蛋白报告基因，含内质网定位序列 |
关键发现
- DBAP培养基（含9μM 2,4-D和4.4μM BAP）培养14天使组织鲜重增加5倍，而CIM培养基仅增加1.4倍
- 优化悬浮培养在21天内最大组织鲜重为起始的4.7倍。从悬浮细胞中分离原生质体得率达3.8×10^5±2.5×10^5个/ml PCV，直径4.9-53.4μm，平均20.7±12.3μm。电穿孔转化（130V, 1000μF）效率为3.3±1.5%，提高电压至300V导致存活率从67.7±3.0%降至11.9±4.5%且无转化
- 500μF时效率降至1.0±0.2%（130V）和0.3±0.4%（300V）。PEG介导转化未能成功。柳枝稷PvUbi2启动子在Arundo原生质体中驱动报告基因表达明显强于CaMV 35S启动子。
研究结论
建立了Arundo donax高效的悬浮培养与原生质体电穿孔瞬时转化系统，证明PvUbi2启动子在Arundo中是强启动子，而35S启动子较弱，为后续Arundo的遗传改良和载体设计提供了重要工具。