Improvement of D-Lactic acid production in Saccharomyces cerevisiae under acidic conditions by evolutionary and rational metabolic engineering†
- 作者
- Seung-Ho Baek, Eunice Y. Kwon, Sang-Jeong Bae, Bo-Ram Cho, Seon-Young Kim, Ji-Sook Hahn
- 单位
- School of Chemical and Biological Engineering, Institute of Chemical Processes, Seoul National University, Seoul, Republic of Korea; Personalized Genomic Medicine Research Center, KRIBB, Daejeon, Republic of Korea
- 杂志
- Biotechnology Journal（2017）
- DOI
- 10.1002/biot.201700015
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酸性发酵条件下，乳酸毒性抑制酿酒酵母生长，导致D-乳酸产量和产率低，需要提高菌株的乳酸耐受性和生产效率。
研究策略
通过敲除乙醇和甘油合成相关基因、表达异源D-乳酸脱氢酶基因(Lm.ldhA)构建产D-乳酸菌株JHY5610，结合适应性实验室进化筛选出高耐受菌株JHY5710，利用全基因组测序鉴定关键突变(SUR1^{I245S}和ERF2功能缺失)，并通过反向工程确认其作用，进一步敲除PDC1并额外整合Lm.ldhA基因，最终获得高效菌株JHY5730。
研究路线图
核心内容
本研究通过代谢工程与适应性实验室进化相结合的策略，构建了在酸性条件下高效生产D-乳酸的酿酒酵母菌株。首先敲除乙醇和甘油合成相关基因并表达异源D-乳酸脱氢酶基因Lm.ldhA，获得基础产酸菌株JHY5610，其D-乳酸产量较初始菌株提高44%（24.7 g/L）。随后通过适应性实验室进化筛选出高耐受菌株JHY5710，D-乳酸产量再提高30%，乙醇产量降低52%。全基因组测序鉴定出SUR1^{I245S}和ERF2功能缺失两个关键突变，反向工程证实二者协同提高乳酸耐受性和产量。进一步敲除PDC1并额外整合Lm.ldhA基因，最终菌株JHY5730在100 g/L葡萄糖摇瓶发酵中产D-乳酸69.7 g/L，得率0.71 g/g；在pH 3.5补料分批发酵中产量达82.6 g/L，得率0.83 g/g，生产力1.50 g/(L·h)。该研究首次揭示SUR1和ERF2突变对乳酸耐受性的作用，为其他有机酸生产菌株的定向改造提供了可借鉴的进化-测序-反向工程策略。
创新点
首次鉴定SUR1^{I245S}和ERF2功能缺失突变协同提高D-乳酸产量；结合适应性进化和全基因组测序指导反向工程；构建了在pH 3.5条件下高产D-乳酸的菌株。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C及其衍生菌株 | D-乳酸合成 | Lm.ldhA | D-乳酸脱氢酶 | 催化 | 来源于Leuconostoc mesenteroides，将丙酮酸转化为D-乳酸 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C及其衍生菌株 | 乙醇合成 | ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5 | 乙醇脱氢酶 | 催化 | 敲除以减少乙醇生成 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C及其衍生菌株 | 甘油合成 | GPD1, GPD2 | 甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 敲除以减少甘油生成 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C及其衍生菌株 | D-乳酸降解 | DLD1 | D-乳酸脱氢酶 | 催化 | 敲除防止D-乳酸分解 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C及其衍生菌株 | 乳酸转运 | JEN1 | 单羧酸转运蛋白Jen1 | 转运 | 编码乳酸转运蛋白，敲除可减少乳酸摄取（本文中未敲除） |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C及其衍生菌株 | 鞘脂生物合成 | SUR1 | Sur1（MIPC合酶催化亚基） | 催化 | SUR1^1245S突变提高乳酸耐受性和D-乳酸产量 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C及其衍生菌株 | 蛋白质棕榈酰化 | ERF2 | Erf2（棕榈酰转移酶亚基） | 催化 | 功能缺失突变提高D-乳酸产量，但单独降低乳酸耐受性 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C及其衍生菌株 | 丙酮酸代谢（乙醇/乙酸合成） | PDC1 | 丙酮酸脱羧酶 | 催化 | 敲除以减少乙酸和乙醇副产物 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C及其衍生菌株 | 柠檬酸循环 | CIT2 | 柠檬酸合酶 | 催化 | 适应性进化中发现的点突变，但作用不显著 |
关键发现
- JHY5610相比JHY5210，葡萄糖摄取提高18%，D-乳酸产量提高44%（JHY5610在50 g/L葡萄糖下消耗38.8 g/L葡萄糖，产D-LA
- 7 g/L）。适应性进化后菌株JHY5710比JHY5610多产30% D-LA，乙醇减少52%，完全消耗50 g/L葡萄糖。全基因组测序发现SUR1^{I245S}突变提高乳酸耐受性，ERF2功能缺失突变提高D-LA产量；双突变菌株JHY5617的葡萄糖消耗和D-LA产量与JHY5710相当。敲除PDC1的JHY5720比JHY5710 D-LA产量提高11%（从37.0 g/L升至41.2 g/L），乙醇和乙酸显著降低。在100 g/L葡萄糖摇瓶发酵中，JHY5730消耗葡萄糖98.2 g/L，产D-LA
- 7 g/L，得率0.71 g/g，生产力0.97 g/(L·h)；在pH
- 5补料分批发酵中，消耗100.0 g/L葡萄糖，产D-LA
- 6 g/L，得率0.83 g/g，生产力1.50 g/(L·h)。
研究结论
通过代谢工程与适应性实验室进化相结合，成功构建了在酸性条件下高效生产D-乳酸的酿酒酵母菌株JHY5730，其产量、得率和生产力分别可达82.6 g/L、0.83 g/g葡萄糖和1.50 g/(L·h)。SUR1和ERF2的突变是提高乳酸耐受性和产量的关键遗传因素，该策略可用于其他有机酸生产菌株的改造。