Production of taxadiene by engineering of mevalonate pathway in Escherichia coli and endophytic fungus Alternaria alternata TPF6
- 作者
- Guangkai Bian, Yujie Yuan, Hui Tao, Xiaofei Shi, Xiaofang Zhong, Yichao Han, Shuai Fu, Chengxiang Fang, Zixin Deng, Tiangang Liu
- 单位
- Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery, Ministry of Education and School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan, China; J1 Biotech Co., Ltd., Wuhan, China; China Center for Type Culture Collection (CCTCC), College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, China; Hubei Engineering Laboratory for Synthetic Microbiology, Wuhan Institute of Biotechnology, Wuhan, China
- 杂志
- Biotechnology Journal（2017）
- DOI
- 10.1002/biot.201600697
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决紫杉醇生产依赖植物、产量有限的问题，通过工程化甲羟戊酸（MVA）途径在大肠杆菌和丝状真菌中生产紫杉二烯（taxadiene），为紫杉醇的微生物合成提供基础。
研究策略
基于已有的法呢烯生产平台，将法呢烯合成模块替换为紫杉二烯合成模块（TS和GGPPS）在大肠杆菌中实现紫杉二烯生产；随后建立农杆菌介导转化（ATMT）方法，评估异源启动子强度，并将MVA途径关键基因（Idi、tHMG1、TS）导入内生真菌A. alternata TPF6中进行代谢工程改造。
研究路线图
核心内容
针对紫杉醇依赖植物提取、产量受限的问题，该研究通过工程化甲羟戊酸途径，在大肠杆菌和内生真菌中实现了紫杉二烯的微生物合成。在大肠杆菌中，将已有的法呢烯合成模块替换为紫杉二烯合成模块（GGPPS与TS），低拷贝质粒菌株T2的紫杉二烯产量达11.3 mg/L（13.2 mg/g DCW），高于高拷贝菌株T4的5.0 mg/L。在真菌A. alternata TPF6方面，研究建立了农杆菌介导转化方法，系统评估了6个异源启动子的强度，发现其跨度超过7000倍，其中alcA启动子最强。通过共过表达Idi、tHMG1和TS，工程菌株GB127经14天发酵后紫杉二烯产量达到61.9 μg/L，这是首次在丝状真菌中检测到紫杉二烯。该工作不仅确立了丝状真菌中MVA途径改造的启动子选择依据和转化体系，也证明了大肠杆菌与真菌作为紫杉醇前体生产平台的可行性，为后续紫杉醇的微生物规模化生产奠定了菌株与工具基础。
创新点
首次在丝状真菌中实现紫杉二烯生产；建立了用于Alternaria属的农杆菌介导转化（ATMT）方法；系统评估了6个异源启动子在A. alternata TPF6中的强度，从而理性设计MVA途径。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA pathway | gppps | geranylgeranyl diphosphate synthase (GGPPS) | 催化 | 催化IPP和DMAPP缩合生成GGPP，为紫杉二烯提供C20前体 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA pathway | ts | taxadiene synthase (TS) | 催化 | 催化GGPP环化生成紫杉二烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MVA pathway | idi | isopentenyl diphosphate isomerase (Idi) | 催化 | 催化IPP与DMAPP的异构化，调节前体比例 |
| Alternaria alternata TPF6 | MVA pathway | idi | isopentenyl diphosphate isomerase (Idi) | 催化 | 在trpC启动子控制下过表达，增强IPP/DMAPP供给 |
| Alternaria alternata TPF6 | MVA pathway | thmg1 | truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (tHMG1) | 催化 | 在oliC启动子控制下过表达，解除途径反馈抑制，增强甲羟戊酸合成 |
| Alternaria alternata TPF6 | MVA pathway | ts | taxadiene synthase (TS) | 催化 | 在alcA启动子控制下过表达，催化生成紫杉二烯 |
关键发现
在大肠杆菌中，菌株T2（低拷贝质粒）紫杉二烯产量为11.3±0.5 mg/L（13.2 mg/g DCW），菌株T4（高拷贝）为5.0±0.7 mg/L（5.9 mg/g DCW）。在A. alternata TPF6中，异源启动子强度从4.5×10^3（gpdA）到3.4×10^7（alcA），跨度超过7000倍，顺序为alcA > agdA > trpC > glaA > oliC > gpdA。通过共过表达Idi、tHMG1和TS，工程菌株GB127经14天发酵后紫杉二烯产量达到61.9±6.3 μg/L，这是首次在丝状真菌中检测到紫杉二烯。
研究结论
本研究通过工程化MVA途径，成功在大肠杆菌和内生真菌A. alternata TPF6中生产紫杉二烯，建立了ATMT转化方法和启动子强度评估体系，获得的GB127菌株为后续紫杉醇及其前体的微生物生产提供了新平台。