Redirection of the glycolytic flux enhances isoprenoid production in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Suryang Kwak, Eun Ju Yun, Stephan Lane, Eun Joong Oh, Kyoung Heon Kim, Yong-Su Jin
- 单位
- Department of Food Science and Human Nutrition, University of Illinois at Urbana-Champaign; Carl R. Woese Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign; Department of Biotechnology, Korea University
- 杂志
- Biotechnology Journal（2020）
- DOI
- 10.1002/biot.201900173
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母在利用葡萄糖时，上部糖酵解通量具有较强的刚性，导致流向氧化戊糖磷酸途径的葡萄糖-6-磷酸通量受限，NADPH 供应不足，从而限制了异戊二烯类化合物的高效生产。
研究策略
通过 CRISPR-Cas9 对磷酸果糖激酶（PFK1 S724D、PFK2 S718D）引入突变以阻断其变构激活，降低上部糖酵解通量；同时用强启动子过表达 ZWF1（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶），将 G6P 通量“推拉”至氧化戊糖磷酸途径，增加 NADPH 供应，并结合 ERG10、tHMG1、ADS 过表达和 ERG9 下调来生产 amorphadiene。
研究路线图
核心内容
本研究针对酿酒酵母中上部糖酵解通量刚性导致葡萄糖-6-磷酸（G6P）向氧化戊糖磷酸途径（PPP）分配受限、NADPH供应不足的问题，提出了一种通过削弱糖酵解并强化PPP来提升异戊二烯类化合物产量的代谢工程策略。作者利用CRISPR-Cas9对磷酸果糖激酶引入PFK1 S724D和PFK2 S718D突变，阻断其变构激活从而降低上部糖酵解通量，同时以强启动子过表达ZWF1编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，将G6P通量“推拉”至氧化PPP以增加NADPH再生。在过表达ERG10、tHMG1、ADS并下调ERG9的amorphadiene生产菌株中，组合策略使[NADPH]/[NADP+]比率较对照提高40%至75%，且仅过表达ZWF1而不削弱糖酵解不足以有效提升该比率。最终SZe-EHA菌株在顺序利用葡萄糖和乙醇后amorphadiene滴度达497 mg/L，分别较对照菌株De-EHA（126 mg/L）、DZe-EHA（295 mg/L）和Se-EHA（266 mg/L）提高3.94、1.68和1.87倍。该研究表明，将上部糖酵解通量转向氧化PPP是增强NADPH供应、提升酿酒酵母异戊二烯类化合物产量的有效且可扩展的策略，对依赖NADPH的其他生物燃料和生物产品生产具有参考意义。
创新点
1. 首次将 PFK 变构激活位点突变与 ZWF1 过表达相结合，协同增强 NADPH 再生；2. 证明仅过表达 ZWF1 不能有效提高 NADPH/NADP+ 比率，必须同时削弱糖酵解通量；3. 在不进行 MVA 途径强工程改造的情况下，通过该策略显著提高了 amorphadiene 产量。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 糖酵解（上部） | PFK1, PFK2 | 磷酸果糖激酶（Pfk1, Pfk2） | 催化 | 引入 S724D 和 S718D 突变，阻断果糖-2,6-二磷酸变构激活，降低糖酵解通量 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 氧化戊糖磷酸途径 | ZWF1 | 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD） | 催化 | 用 P_CCW12 强启动子替换原启动子进行过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ERG10 | 乙酰-CoA C-乙酰转移酶 | 催化 | 过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | tHMG1 | 截短的 HMG-CoA 还原酶同工酶 1（tHMG1） | 催化 | 过表达，去除调控域 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | amorphadiene 合成 | ADS | amorphadiene 合酶 | 催化 | 过表达 |
| Saccharomyces cerevisiae D452-2 | 麦角固醇（甾醇）合成 | ERG9 | 角鲨烯合酶 | 催化 | 用弱启动子 P_SYH1 替换其启动子以降低表达 |
关键发现
- PFK 突变（Pfk1 S724D、Pfk2 S718D）降低了甘油产量并增加了 G6P、F6P 积累；ZWF1 过表达提高 G6PD 活性并降低乙酸产量。组合突变与过表达使 [NADPH]/[NADP+] 比率在 SZe 菌株中比 De、DZe、Se 分别提高 75%、46%、40%。在过表达 ERG10、tHMG1、ADS 的菌株中，SZe-EHA 在葡萄糖利用阶段 amorphadiene 产量比对照 De-EHA 高
- 7 倍，最终在顺序利用葡萄糖和乙醇后达到 497 mg/L 的 amorphadiene 滴度，分别比 De-EHA（126 mg/L）、DZe-EHA（295 mg/L）、Se-EHA（266 mg/L）高
- 94、1.68、1.87 倍。
研究结论
将上部糖酵解通量转向氧化戊糖磷酸途径是通过增强 NADPH 供应来提高酿酒酵母异戊二烯类化合物产量的有效策略。PFK 突变与 ZWF1 过表达具有协同作用，该策略可扩展至其他依赖 NADPH 的生物燃料和生物产品生产。