Fast-track adaptive laboratory evolution of Cupriavidus necator H16 with divalent metal cations
- 作者
- Sepwin Nosten Sitompul, Laura Andrea Diaz Garcia, Joseph Price, Kang Lan Tee, Tuck Seng Wong
- 单位
- Department of Chemical & Biological Engineering, University of Sheffield, Sheffield, UK; Evolutor Ltd, The Innovation Centre, Sheffield, UK; National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), National Science & Technology Development Agency (NSTDA), Khlong Luang, Pathum Thani, Thailand; School of Pharmacy, Bandung Institute of Technology, Bandung, West Java, Indonesia
- 杂志
- Biotechnology Journal（2024）
- DOI
- 10.1002/biot.202300577
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
传统适应性实验室进化（ALE）耗时长且往往依赖基因改造菌株或致癌性诱变剂，本文旨在开发一种利用二价金属阳离子加速遗传多样性创建的快速ALE工作流，以高效获得能耐受高浓度甘油的Cupriavidus necator H16菌株。
研究策略
以CoCl2、MnCl2、ZnCl2处理C. necator H16诱导随机突变，再以10% v/v甘油作为选择压力进行“诱变-选择”循环（aALE），从富集群体中筛选耐受高浓度甘油的突变株，并通过基因组测序和结构模拟分析突变效应。
研究路线图
核心内容
本研究开发了一种利用二价金属阳离子（CoCl₂、MnCl₂、ZnCl₂）加速适应性实验室进化（aALE）的工作流，以快速获得耐受高浓度甘油的Cupriavidus necator H16菌株。该方法通过金属离子诱导随机突变，再以10% v/v甘油为选择压力进行诱变-选择循环，完全避免了对转基因菌株、专门遗传工具或致癌性诱变剂的依赖。经两个aALE循环获得的突变株Mn-C2-B11在10%和15% v/v甘油中的最终OD600分别达56.0和48.9，干重为15.2和12.7 g/L，而野生型仅分别为39.1/8.4 g/L和9.0/3.1 g/L；该菌株在10%甘油下消耗的甘油量是野生型的34.5倍，且其性能与既往需6轮传统ALE获得的菌株相当。基因组测序揭示Mn-C2-B11携带glpK A264V和W480S双突变及ygcG G253W突变，结构模拟显示GlpK主甘油结合腔体积从野生型的4914 ų显著缩小至双突变体的1147 ų，并出现与S480相关的新结合位点。该工作流安全、高效、成本低，可在1–3个循环内获得目标表型，为微生物菌株工程提供了可推广的通用工具。
创新点
首次将二价金属离子用于ALE；不依赖转基因菌株、专门遗传工具或潜在致癌的DNA修饰剂；通过扩增遗传多样性显著缩短获得目标表型的进化时间；该工作流可推广至其他微生物菌株。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Cupriavidus necator H16 | 甘油代谢 | glpK | 甘油激酶 (GlpK) | 催化 | 催化甘油磷酸化为3-磷酸甘油；Mn-C2-B11含A264V和W480S双突变，Co-C3-F3和v6C6含W480S突变，与高浓度甘油耐受相关 |
| Cupriavidus necator H16 | 应激响应/渗透胁迫 | ygcG | YgcG家族蛋白（推定磷酸酶） | 调控 | 预测具有跨膜结构域，G253W突变与膜应激耐受表型相关 |
关键发现
- 经aALE获得的Mn-C2-B11在10% v/v甘油中最终OD600为56.0，干重15.2 g/L，而野生型（WT）分别为39.1和8.4 g/L
- 在15% v/v甘油中，Mn-C2-B11最终OD600为48.9、干重12.7 g/L，WT仅9.0和3.1 g/L。HPLC分析表明，Mn-C2-B11在10%甘油下消耗的甘油量是WT的34.5倍。该菌株在2个aALE循环后获得（MnCl2处理），而单循环的Mn-C1-D3性能与既往6轮ALE的v6C6相当。基因组测序确认突变存在，MnCl2和CoCl2诱变效果显著高于ZnCl2
- Mn-C2-B11携带glpK A264V和W480S双突变，Co-C3-F3和v6C6含W480S
- Mn-C2-B11和Co-C3-F3均含ygcG G253W突变。结构模拟显示GlpK主甘油结合腔体积从WT的4914 Å^3降至单突变型1027 Å^3和双突变型1147 Å^3，且双/单突变体中出现与S480相关的新甘油结合位点。
研究结论
本研究成功建立了一种安全、高效且成本低的加速适应性实验室进化（aALE）工作流，利用二价金属阳离子作为诱变剂，在1-3个循环内快速获得能耐受10%乃至15% v/v高浓度甘油的Cupriavidus necator H16菌株，为微生物菌株工程和生物过程优化提供了有力工具。