高级醇 · 代谢工程文献库

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A strong hybrid fatty acid inducible transcriptional sensor built from Yarrowia lipolytica upstream activating and regulatory sequences.

作者
Murtaza Shabbir-Hussain, Ian Wheeldon, Mark A. Blenner
单位
Chemical & Biomolecular Engineering, Clemson University, Clemson, USA; Chemical & Environmental Engineering, University of California Riverside, Riverside, USA
杂志
Biotechnology Journal（2017）
DOI
10.1002/biot.201700248
所属领域
合成生物学 / 代谢工程
关键词
Fatty acid sensorHybrid promoterPOX2Transcriptional regulationUpstream activating sequenceUpstream regulatory sequenceYarrowia lipolytica
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解决的核心问题

在解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中缺乏既强又受脂肪酸诱导的启动子，限制了脂质衍生化学品的生物生产效率。

研究策略

通过对POX2天然启动子进行5'端和3'端系统截短，鉴定出脂肪酸响应性上游激活序列（UASs）和上游调控序列（URSs），并将它们模块化组合成杂合启动子，利用串联重复的R1序列增强脂肪酸诱导表达强度。

研究路线图

100%
研究问题：缺乏强脂肪酸诱导启动子
策略：截短POX2启动子鉴定调控序列
关键改造1：模块化组合UAS与URS
关键改造2：串联重复R1增强表达
结果1：A1(R1x3)A3诱导48倍表达
结果2：多种脂肪酸诱导且不受葡萄糖阻遏
结果3：替换核心启动子表达再提3倍
结论：最强脂肪酸传感器A1(R1x3)A3
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核心内容

针对解脂耶氏酵母中缺乏强脂肪酸诱导启动子的问题，该研究系统截短了天然POX2启动子的5'端和3'端，定位到脂肪酸响应性上游激活序列与上游调控序列，并通过模块化组合构建了系列杂合启动子。通过串联重复关键上游调控序列R1，获得最强候选A1(R1x3)A3。该启动子在油酸诱导下可达约48倍诱导水平，显著高于天然POX2启动子的19倍，且表达强度为后者的4倍；将核心启动子替换为TEF(136)或TEF-intron后，表达强度进一步提升至天然启动子的10倍以上。该启动子可被油酸、亚油酸等多种脂质有效诱导，且在葡萄糖、甘油等碳源下保持强抑制状态，不受葡萄糖分解代谢物阻遏，与甘油共培养时还呈现协同增强效应。研究揭示了R1序列与上游激活序列A1之间的协同激活作用，所构建的A1(R1x3)A3成为目前该菌株中最强的脂肪酸诱导型启动子，可作为脂肪酸传感器、动态代谢调控工具或毒性基因的诱导表达元件，为脂质衍生化学品的生产调控提供了有力工具。

创新点

首次在解脂耶氏酵母中理性设计出最强脂肪酸诱导型杂合启动子A1(R1x3)A3；发现R1序列与A1序列具有协同激活作用；该启动子不受葡萄糖分解代谢物阻遏。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Yarrowia lipolytica PO1f 脂肪酸β氧化 POX2 过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶2 催化 天然脂肪酸诱导启动子来源基因，其启动子被用于构建杂合启动子
Yarrowia lipolytica PO1f 脂肪酸代谢调控 POR1 Por1p（FarA同源转录因子） 调控 推测结合R1区域的脂肪酸响应转录因子
Yarrowia lipolytica PO1f 启动子调控 TEF1-α 翻译延伸因子1-α 调控 其核心启动子元件（TEF136和TEF-intron）被用于替换POX2核心启动子以增强表达
Yarrowia lipolytica PO1f 启动子工程 hrGFP 绿色荧光蛋白 调控 作为报告基因用于定量启动子强度
Yarrowia lipolytica PO1f 脂肪酸代谢 POT1 过氧化物酶体3-酮脂酰硫解酶 催化 其启动子也被用作脂肪酸诱导型启动子（文中提及）
Yarrowia lipolytica PO1f 脂质代谢 LIP2 脂肪酶2 催化 其启动子为脂肪酸诱导型启动子，并与POX2启动子有协同现象（文中提及）

关键发现

  1. 鉴定出200 bp上游调控序列R1
  2. A1(R1x3)A3杂合启动子在油酸诱导下相对葡萄糖的诱导倍数达48倍，比天然POX2启动子（19倍诱导）高出约2.5倍，且在油酸条件下的表达强度为天然POX2启动子的4倍
  3. 该启动子可被油酸、亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和甘油三酯等多种脂肪酸/脂质诱导，其中亚油酸诱导最强
  4. 在葡萄糖、甘油和正癸烷条件下保持强抑制
  5. 与甘油和油酸共培养时表达协同增强
  6. 将核心启动子替换为TEF(136)或TEF-intron核心启动子后表达分别再提高2倍和3倍，使表达水平比天然POX2启动子高10倍以上。

研究结论

通过解析POX2启动子中的UAS和URS元件，成功构建了目前解脂耶氏酵母中最强的脂肪酸诱导型杂合启动子A1(R1x3)A3，其兼具高强度与强诱导性，可用作脂肪酸传感器、代谢动态调控工具及毒性基因诱导表达工具。