The In Vivo Synthesis of Plant Sesquiterpenes by Escherichia coli
- 作者
- Vincent J.J. Martin, Yasuo Yoshikuni, Jay D. Keasling
- 单位
- Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley, CA 94720-1462
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2001）
- DOI
- 10.1002/bit.10037
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
评估大肠杆菌体内合成植物倍半萜的潜力，并确定影响产量的关键因素，尤其是环化酶表达与前体FDP供应哪个是限制步骤。
研究策略
将三种植物倍半萜环化酶基因（TEAS、Cad、HVS）克隆至pTrc99A和pBAD24载体并在大肠杆菌中表达；系统优化培养条件（培养基、温度、pH、碳源、宿主菌株），并共表达稀有tRNA基因（RIL质粒）和dxs基因以改善蛋白表达和前体供应。
研究路线图
核心内容
该研究将三种植物倍半萜环化酶基因（烟草5-epi-aristolochone环化酶、棉花(+)-δ-cadinene环化酶和天仙子vetispiradiene环化酶）克隆至pTrc99A和pBAD24载体，在大肠杆菌DH5α中实现异源表达，并通过系统优化培养基、温度、碳源及共表达稀有tRNA和dxs基因，考察体内合成植物倍半萜的潜力。结果显示，最高产量分别为(+)-δ-cadinene 10.3 μg/L培养物、5-epi-aristolochone 0.24 μg/L（当量计）和vetispiradiene 6.4 μg/L（当量计），最佳条件为DH5α菌株、pTrc99A载体和M9培养基加0.2%甘油。关键是，共表达dxs基因对产量无显著影响，而倍半萜产量比类胡萝卜素低逾500倍，表明限制步骤并非FDP前体供应，而是环化酶表达不足；产物主要在指数生长期合成，且(+)-δ-cadinene易挥发。该工作首次证明大肠杆菌可合成多种植物倍半萜，并指出提升环化酶表达水平是工程化改造的关键方向，为后续微生物生产植物萜类化合物提供了重要依据。
创新点
首次在大肠杆菌中实现多种植物倍半萜的体内合成；通过系统优化确定了最佳培养条件；发现环化酶表达不足是产量瓶颈，而非FDP前体供应。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 倍半萜合成途径（以FDP为底物） | TEAS | 5-epi-aristolochone cyclase（烟草） | 催化 | 编码5-epi-aristolochone合酶，催化FDP环化生成5-epi-aristolochone |
| Escherichia coli DH5α | 倍半萜合成途径（以FDP为底物） | Cad | (+)-δ-cadinene cyclase（棉花） | 催化 | 编码(+)-δ-cadinene合酶，催化FDP环化生成(+)-δ-cadinene |
| Escherichia coli DH5α | 倍半萜合成途径（以FDP为底物） | HVS | vetispiradiene cyclase（天仙子） | 催化 | 编码vetispiradiene合酶，催化FDP环化生成vetispiradiene |
| Escherichia coli DH5α | 非甲羟戊酸（MEP）途径 | dxs | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | 共表达dxs以增加FDP前体通量，但未显著提高倍半萜产量 |
| Escherichia coli DH5α | 蛋白质翻译 | argU, ileY, leuW | 稀有tRNA（Arg, Ile, Leu） | 调控 | RIL质粒提供稀有密码子tRNA，影响环化酶翻译效率和倍半萜产量 |
关键发现
- 最高产量分别为：(+)-δ-cadinene
- 3 μg/L培养物、5-epi-aristolochone
- 24 μg/L（以(+)-δ-cadinene当量计）、vetispiradiene
- 4 μg/L（以(+)-δ-cadinene当量计）。最佳条件：DH5α菌株、pTrc99A载体（Ptrc启动子）、M9培养基+0.2%甘油；5-epi-aristolochone和vetispiradiene在30°C产量最高，而(+)-δ-cadinene在39°C最高。倍半萜产量比类胡萝卜素产量低>500倍。共表达dxs基因对倍半萜产量无显著影响。倍半萜主要在指数生长期合成，不在稳定期积累；(+)-δ-cadinene易挥发。
研究结论
大肠杆菌中植物倍半萜合成的限制因素是环化酶的表达水平，而不是FDP前体供应；通过优化培养条件和表达策略可提高产量，为工程化植物倍半萜环化酶用于微生物生产提供了依据。