Enhanced Transglucosylation/Hydrolysis Ratio of Mutants of Pyrococcus furiosus β-Glucosidase: Effects of Donor Concentration, Water Content, and Temperature on Activity and Selectivity in Hexanol
- 作者
- Therese Hansson, Patrick Adlercreutz
- 单位
- Department of Biotechnology, Center for Chemistry and Chemical Engineering, Lund University, P.O. Box 124, SE-221 00 Lund, Sweden
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2001）
- DOI
- 10.1002/bit.10043
- 所属领域
- 酶工程/生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
如何提高糖苷水解酶的转糖苷/水解选择性，减少水解副产物并提高转糖苷产物收率
研究策略
对来自Pyrococcus furiosus的β-葡萄糖苷酶CelB进行活性位点定点突变（M424K、F426Y、M424K/F426Y），系统考察供体（pentyl-β-glucoside）浓度、水含量和温度对酶活性与选择性的影响
核心内容
本研究围绕提高糖苷水解酶转糖苷/水解选择性的问题，对来自Pyrococcus furiosus的β-葡萄糖苷酶CelB进行了活性位点定点突变，构建了M424K、F426Y及M424K/F426Y三种突变体，并在己醇体系中系统考察了供体浓度、水含量和温度对酶活性与选择性的影响。结果表明，F426Y突变使转糖苷/水解选择性S值从野生型的1.9提高至4.9，提升2.6倍，己基-β-D-葡萄糖苷产率从56%升至69%；该突变体的转糖苷/水解特异性常数比达野生型的2.6倍。在低水活度（aw=0.29）下，F426Y仍保有0.21 μmol/min/mg的转糖苷活性，而野生型几乎丧失活性；在aw=0.64时，F426Y保留最大活性的13%，野生型仅3%。所有突变体的Vmax均低于野生型，其中F426Y降低75%。选择性在50-95°C范围内基本不变，随水活度升高至0.92而上升。新引入酪氨酸羟基或通过形成氢键、捕获水分子调控选择性，为糖苷酶转糖苷化工程改造提供了新策略。
创新点
发现F426Y突变可使转糖苷/水解选择性（S值）提高2.6倍，且突变体在低水活度下仍保持转糖苷活性；揭示了活性位点芳香族残基对选择性的调控机制
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | β-葡萄糖苷水解/转糖苷 | celB | CelB (野生型及突变体 M424K, F426Y, M424K/F426Y) | 催化 | 重组表达宿主用于产生CelB酶；酶催化pentyl-β-D-glucoside转化为hexyl-β-D-glucoside（转糖苷）或葡萄糖（水解） |
关键发现
['F426Y突变使选择性S值提高2.6倍（从1.9升至4.9），己基-β-D-葡萄糖苷产率从56%提高至69%', 'M424K、F426Y、M424K/F426Y三种突变体的转糖苷/水解特异性常数比分别比野生型提高1.8、2.6、1.9倍', '在aw=0.29时，F426Y突变体仍有0.21 μmol/min/mg的转糖苷活性，而野生型几乎无活性', '在aw=0.64时，F426Y突变体保留其最大活性的13%，野生型仅3%', '在50-95°C范围内，两者的选择性基本不变', '选择性随水活度增加至0.92而升高，更高水含量时下降', '野生型和突变体的活性随水活度增加，在20%水相两相系统中几乎完全激活（水饱和己醇中野生型保留37%活性，F426Y为41%）', '所有突变体的Vmax均低于野生型，F426Y降低75%，M424K降低23%']
研究结论
F426Y突变显著提高了CelB的转糖苷/水解选择性，其机制可能与新引入的酪氨酸羟基与底物形成氢键或捕获水分子有关，为糖苷酶的转糖苷化工程改造提供了依据