Expression of galP and glk in a Escherichia coli PTS Mutant Restores Glucose Transport and Increases Glycolytic Flux to Fermentation Products
- 作者
- Verónica Hernández-Montalvo, Alfredo Martínez, Georgina Hernández-Chavez, Francisco Bolivar, Fernando Valle, Guillermo Gosset
- 单位
- Departamento de Microbiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuernavaca, Morelos, México; Genencor International, Inc., Palo Alto, California
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2003）
- DOI
- 10.1002/bit.10702
- 所属领域
- 代谢工程
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解决的核心问题
大肠杆菌PTS系统在葡萄糖转运时消耗磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，不利于需要PEP为前体的产物合成；本研究旨在通过非PTS途径恢复葡萄糖转运并提高糖酵解通量。
研究策略
构建不同强度的trc衍生启动子家族，调控galP和glk在PTS突变株VH32中的表达，单独或组合表达并表征其生长和产物生成；进一步引入乙醇合成途径评估产物产量。
研究路线图
核心内容
该研究针对大肠杆菌磷酸转移酶系统（PTS）在葡萄糖转运时消耗磷酸烯醇式丙酮酸、不利于依赖该前体合成产物的问题，在PTS缺陷菌株VH32中利用强度可调的trc衍生启动子家族，单独或组合表达半乳糖通透酶基因galP和葡萄糖激酶基因glk，以重建非PTS葡萄糖摄取途径。结果显示，单独表达galP即可将菌株比生长速率从0.03 h⁻¹恢复至0.55 h⁻¹，达到野生型W3110的89%；同时表达galP与glk时比生长速率可达0.59–0.64 h⁻¹，与野生型相当，且葡萄糖转运速率比W3110高40%。启动子强度范围覆盖野生型trc1的8%至85%。由于非PTS途径不消耗PEP，所有重组菌的乙酸比生产率和产率约为野生型的两倍。进一步引入pdc和adhB构建乙醇合成途径后，重组菌在生长阶段乙醇比生产率为0.2 g/g细胞/h，非生长阶段为0.15，均高于野生型对照的0.1。研究表明，通过异源表达galP和glk可在不消耗PEP的前提下恢复葡萄糖转运与磷酸化，使更多碳流导向糖酵解产物，为代谢工程改造提供了有效策略。
创新点
1. 开发了强度可调的trc启动子家族；2. 证明单独表达galP即可恢复PTS-菌株的葡萄糖生长表型；3. 同时表达galP和glk可将糖酵解通量导向乙酸和乙醇，产量提高约两倍。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli VH32 | PTS葡萄糖转运 | ptsH, ptsI, crr | HPr, 酶I, IIAGlc, IICBGlc | 转运 | 敲除PTS基因，消除PTS依赖的葡萄糖摄取，导致μ=0.03 h^-1 |
| Escherichia coli VH32 | 葡萄糖转运（非PTS） | galP | GalP (半乳糖通透酶) | 转运 | 从trc启动子表达，恢复葡萄糖摄取，单独表达使μ达0.55 h^-1 |
| Escherichia coli VH32 | 糖酵解/葡萄糖磷酸化 | glk | Glk (葡萄糖激酶) | 催化 | 与galP共表达时提高葡萄糖磷酸化，消除生长限制 |
| Escherichia coli VH32/pv4Glk5GalP | 乙醇发酵 | pdc | 丙酮酸脱羧酶 (PdcZm) | 催化 | 来自运动发酵单胞菌，与adhB共表达将丙酮酸转化为乙醇 |
| Escherichia coli VH32/pv4Glk5GalP | 乙醇发酵 | adhB | 乙醇脱氢酶II (AdhBZm) | 催化 | 来自运动发酵单胞菌，催化乙醛还原为乙醇 |
关键发现
- VH32（PTS-）在葡萄糖上μ仅0.03 h^-1；表达galP(trc1)后μ为0.55 h^-1，达W3110(0.62 h^-1)的89%。单独表达glk无改善，同时表达galP和glk的菌株μ可达0.59-0.64 h^-1，与W3110相当。启动子强度范围为野生型trc1的8%至85%。VH32/pCLv1GalP的葡萄糖转运速率比W3110高40%（93.89 vs
- 36 nmol min^-1 mg^-1蛋白）。所有PTS-重组菌的乙酸比生产率和产率约为W3110的两倍（qHAc
- 74-3.4 vs
- 43 g/gDCW/h，YHAc/Glc
- 36-0.43 vs
- 17）。引入pdc和adhB后，VH32/pv4Glk5GalP/pLOI1594的乙醇比生产率在生长阶段为0.2 gEtOH gX^-1 h^-1，非生长阶段为0.15，而W3110对照为0.1。
研究结论
在PTS缺陷大肠杆菌中，通过异源表达galP和glk可有效恢复葡萄糖转运和磷酸化，且因不消耗PEP，碳流更多地流向糖酵解产物（乙酸、乙醇），为代谢工程改造提供了新策略。