Development of Expression Systems for the Production of Recombinant Human Serum Albumin Using the MOX Promoter in Hansenula polymorpha DL-1
- 作者
- Hyun Ah Kang, Whankoo Kang, Won-Kyoung Hong, Moo Woong Kim, Jeong-Yoon Kim, Jung-Hoon Sohn, Eui-Sung Choi, Keun-Bum Choe, Sang Ki Rhee
- 单位
- Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology; Department of Chemical Engineering, Hannam University; Department of Microbiology, Chungnam National University; Dong Kook Pharmaceutical Company, LTD.
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2001）
- DOI
- 10.1002/bit.1157
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在汉逊酵母DL-1中利用甲醇诱导MOX启动子高效分泌表达重组人血清白蛋白，解决表达效率受5'UTR、基因拷贝数和宿主甲醇氧化酶竞争等限制的问题。
研究策略
优化表达盒的5'UTR、分析基因拷贝数与整合位点的影响，构建MOX基因破坏的moxΔ菌株，并通过摇瓶和补料分批发酵比较不同诱导模式下HSA的生产性能。
研究路线图
核心内容
本研究以汉逊酵母DL-1为宿主，利用甲醇诱导型MOX启动子构建重组人血清白蛋白（HSA）分泌表达系统，系统优化了表达盒5′非翻译区（UTR）、基因拷贝数及宿主甲醇代谢背景。去除HSA cDNA的5′-UTR使表达效率提升至少5倍，且单拷贝整合即可实现最大表达，多拷贝不再增加转录水平，消除了基因剂量效应。进一步构建MOX基因破坏的moxΔ菌株，在0.5%甲醇摇瓶培养中HSA产量达70 mg/L，而MOX野生型仅5 mg/L；补料分批发酵中，moxΔ菌株在突然切换诱导模式下的比生产速率为0.34 mg/L·h·OD660，约为野生型（0.12）的2.8倍，而野生型在逐步切换模式下获得最高HSA浓度1.3 g/L。产物N端序列正确，等电点约4.8，与天然HSA一致。结果表明，结合表达盒优化与MOX基因缺陷策略，仅单拷贝整合即可实现高水平正确加工的重组HSA分泌，moxΔ菌株简化了甲醇补料操作，具备规模化生产潜力。
创新点
["去除HSA cDNA的5'-UTR使表达效率提升至少5倍", '优化后单拷贝表达盒即可实现最大HSA表达，消除基因剂量效应', '构建moxΔ菌株，在低甲醇浓度和高密度诱导下显著提高HSA产量及比生产速率']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Hansenula polymorpha DL-1 | — | — | — | 调控 | 宿主菌株，包括MOX野生型和moxΔ突变体，其遗传背景影响重组蛋白表达 |
| Hansenula polymorpha DL-1 | 甲醇代谢 | MOX | 甲醇氧化酶 | 催化 | MOX启动子驱动HSA表达；moxΔ菌株中MOX基因被HSA表达盒替换，消除甲醇氧化酶对底物的竞争 |
| Hansenula polymorpha DL-1 | 人血清白蛋白分泌 | HSA | 人血清白蛋白 | 转运 | 重组HSA借助天然prepro信号肽分泌到胞外，正确加工为成熟蛋白 |
| Hansenula polymorpha DL-1 | — | HSA cDNA 5'-UTR | — | 调控 | 去除HSA cDNA来源的5'-UTR并优化启动子融合，显著提高翻译效率 |
关键发现
- 去除5'-UTR后HSA表达效率提高至少5倍
- 单拷贝整合足以达到最大表达，多拷贝不再增加HSA转录水平
- moxΔ菌株在0.5%甲醇摇瓶培养中HSA产量达70 mg/L，而MOX野生型仅5 mg/L
- 在补料分批发酵的突然切换诱导模式下，moxΔ菌株的比HSA生产速率为0.34 mg/L·h·OD660，是MOX野生型(0.12)的约2倍
- MOX野生型在逐步切换模式下获得最高HSA浓度1.3 g/L
- 重组HSA的N端序列正确，pI约4.8，与天然HSA一致。
研究结论
通过优化表达盒和利用MOX基因缺陷表型，开发的汉逊酵母表达系统能仅以单拷贝整合实现正确加工的高水平重组HSA分泌，尤其moxΔ菌株有利于简化甲醇补料操作并适用于大规模生产。