Coexpression in Yeast of Taxus Cytochrome P450 Reductase With Cytochrome P450 Oxygenases Involved in Taxol Biosynthesis
- 作者
- Stefan Jennewein, Hangil Park, JingHong M. DeJong, Robert M. Long, Arthur P. Bollon, Rodney B. Croteau
- 单位
- Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, Washington 99164-6340; eXegenics Inc., 2110 Research Row, Dallas, Texas 75235
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2005）
- DOI
- 10.1002/bit.20390
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酵母中异源表达紫杉醇生物合成相关的细胞色素P450酶时，需要合适的NADPH:细胞色素P450还原酶进行电子传递以支持羟化酶活性，而内源酵母还原酶效率较低，需要克隆并利用同源的紫杉（Taxus）还原酶来增强P450羟基化效率。
研究策略
从Taxus cuspidata中克隆NADPH:细胞色素P450还原酶cDNA，在昆虫细胞（Sf9）中表达和表征，并在酵母中与紫杉醇10β-羟化酶和13α-羟化酶共表达，比较不同来源及不同截短形式的还原酶对羟化酶活性的影响。
研究路线图
核心内容
为提升紫杉醇生物合成途径中P450羟化酶在酵母中的催化效率，该研究从红豆杉（Taxus cuspidata）中克隆了全长2941 bp、编码717个氨基酸的NADPH:细胞色素P450还原酶（TCPR）cDNA。在昆虫细胞Sf9中表达后，该还原酶活性超过200 mU/mg蛋白，约为此前内源活性的15倍，其Km(NADPH)为17.8±2.9 μM。在酵母中共表达全长红豆杉还原酶与紫杉醇10β-羟化酶，使羟化酶活性达到164±18 nmol/h/mg蛋白，比仅依赖内源酵母还原酶（23.4±4.4）增强约7倍；添加大鼠细胞色素b5可再提高60%活性。然而13α-羟化酶活性未显著提高（约18 vs 16 nmol/h/mg蛋白），推测该酶在酵母微粒体中不稳定。研究还发现去除N端膜锚和C端标签的截短还原酶活性最高，较空载体对照高约8倍。结果表明，功能性同源氧化还原耦合是重建紫杉醇生物合成的重要初始步骤，为后续在酵母中完整重构该复杂途径奠定了基础。
创新点
首次从红豆杉克隆并表征了细胞色素P450还原酶；在酵母中实现了同源红豆杉还原酶与紫杉醇P450羟化酶的功能性共表达，显著提高了10β-羟化酶活性；发现N端膜锚序列和C端标签会降低还原酶的表达和活性。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 紫杉醇生物合成 | TCPR | NADPH:细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 从Taxus cuspidata克隆，与P450羟化酶共表达，为羟化酶提供电子 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 紫杉醇生物合成 | — | 细胞色素P450 taxoid 10β-羟化酶 | 催化 | GenBank AF318211，催化taxadien-5α-yl acetate的10β-羟基化 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 紫杉醇生物合成 | — | 细胞色素P450 taxoid 13α-羟化酶 | 催化 | 催化taxadien-5α-ol的13α-羟基化，在酵母中不稳定 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 紫杉醇生物合成 | — | 内源NADPH:细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 作为对照，支持基础水平的羟化酶活性 |
| 草地贪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) Sf9细胞 | 紫杉醇生物合成 | TCPR | NADPH:细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 用于重组还原酶的表达和表征，以及与10β-羟化酶的共表达实验 |
关键发现
- 克隆的T. cuspidata还原酶cDNA全长2941 bp，ORF 2154 bp，编码717个氨基酸，基因组中为单拷贝
- 其序列与裸子植物还原酶相似性约90%，与被子植物为75-80%。在昆虫细胞中表达后，还原酶活性超过200 mU/mg蛋白，约为内源活性的15倍
- Km(NADPH)为17.8±2.9 μM。昆虫细胞中共表达还原酶与10β-羟化酶使羟化酶活性提高3倍
- 添加大鼠细胞色素b5可使活性再相对提高60%。在酵母中，共表达全长红豆杉还原酶使10β-羟化酶活性达到164±18 nmol/h/mg蛋白，而仅依赖内源酵母还原酶时为23.4±4.4，即约7倍增强。13α-羟化酶活性未显著提高（约18 vs 16 nmol/h/mg蛋白）。截短形式（去除N端膜锚和C端标签）的还原酶活性最高，比空载体对照高约8倍。
研究结论
同源的红豆杉NADPH:细胞色素P450还原酶能在酵母中有效支持紫杉醇10β-羟化酶的活性，功能性转基因氧化还原耦合是重建紫杉醇生物合成的重要初始步骤；13α-羟化酶因在酵母微粒体中不稳定未能显示出增强，需进一步优化表达系统或采用体内喂养实验评估。