Metabolic Analysis of the Synthesis of High Levels of Intracellular Human SOD in Saccharomyces cerevisiae rhSOD 2060 411 SGA122
- 作者
- Ramon Gonzalez, Barbara A. Andrews, Julia Molitor, Juan A. Asenjo
- 单位
- Centre for Biochemical Engineering and Biotechnology, Department of Chemical Engineering, Millennium Institute for Advanced Studies in Cell Biology and Biotechnology, University of Chile
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2003）
- DOI
- 10.1002/bit.10556
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
定量研究酿酒酵母中高水平人超氧化物歧化酶（SOD）合成对代谢网络的影响，并解析重组蛋白合成造成的代谢负担。
研究策略
构建包含78个反应的化学计量模型，利用间歇培养中测定的底物、产物和细胞组分等通量数据，对重组菌株（P+）和野生型（P-）在葡萄糖和乙醇上的双峰生长过程进行代谢通量分析。
研究路线图
核心内容
该研究通过化学计量模型与代谢通量分析，定量比较了重组人超氧化物歧化酶（SOD）酿酒酵母菌株与野生型菌株在葡萄糖和乙醇双峰生长阶段的代谢差异。结果显示，重组菌株在两种碳源上的比生长速率分别较野生型降低34%和53%，而野生型的菌体/底物产率分别高出49%和38%，ATP合成通量及ATP/底物产率也高出约50%。重组菌株在葡萄糖生长期64%的能量来自底物水平磷酸化，其总蛋白和RNA含量高于野生型，但碳水化合物和脂类较低，SOD最高可占细胞总蛋白的30%。野生型的TCA循环和磷酸戊糖途径通量分别高出约60%和80%，而进入稳定期时重组菌株有22个反应通量上升，与SOD合成增加相关。这些结果定量揭示了重组蛋白合成对中心碳代谢的负担模式，表明呼吸发酵期的活跃生长和从生长到非生长的代谢转变最有利于SOD积累，为采用非生长关联型启动子优化表达策略提供了代谢层面的依据。
创新点
首次利用代谢通量分析量化重组SOD合成对酿酒酵母代谢通量分布的影响；区分呼吸发酵与氧化代谢条件下SOD合成与代谢负担的关系；发现进入稳定期时重组菌株有22个反应通量上升，与SOD合成增加相关。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae rhSOD 2060 411 SGA122 | 糖酵解 | — | — | 催化 | 重组菌株P+，含有质粒pC1/1PGAPSOD，组成型表达人SOD |
| Saccharomyces cerevisiae rhSOD 2060 411 SGA122 | 中心碳代谢 | — | — | 催化 | 野生型菌株P-，不含表达载体，不产SOD，亮氨酸营养缺陷型 |
| — | 人超氧化物歧化酶合成 | SOD | 人Cu/Zn超氧化物歧化酶 | 催化 | 由GAP启动子组成型表达，分子量32.5 kDa，含两个Cu和两个Zn原子 |
| — | 糖酵解 | — | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP） | 催化 | GAP启动子用于驱动SOD基因表达 |
| — | 磷酸戊糖途径 | — | — | 调控 | P+菌株PP途径通量低于P-，但进入稳定期时PP途径通量增加约20% |
| — | TCA循环 | — | — | 调控 | P+菌株TCA循环通量低于P-，与SOD合成导致的代谢负担相关 |
| — | 乙醛酸循环 | — | — | 调控 | 乙醇生长时激活，葡萄糖生长时失活；P+和P-在乙醇阶段均激活 |
| — | 氨基酸生物合成 | — | — | 调控 | P+进入稳定期时12个氨基酸合成反应通量增加，与SOD合成增加相关 |
| — | 能量代谢 | — | — | 能量供给 | 氧化磷酸化P/O比设为1.09；P+在葡萄糖生长期64%能量来自底物水平磷酸化 |
| — | 转运 | — | — | 转运 | 模型包含乙酰辅酶A从细胞质到线粒体的转运反应（反应75），仅在乙醇生长时激活 |
关键发现
- 重组菌株P+在葡萄糖和乙醇上的比生长速率分别比野生型P-降低34%和53%（原文摘要中为54%，结论中为53%，以结论为准）；P-的菌体/底物产率分别比P+高49%（葡萄糖）和38%（乙醇）；P-的ATP合成通量和ATP/底物产率均比P+高约50%；P+在葡萄糖生长期间64%的能量来自底物水平磷酸化；P+的总蛋白和RNA含量高于P-（蛋白49.23% vs
- 69%，RNA
- 96% vs
- 70%），碳水化合物和脂类较低；P+的SOD最高占细胞总蛋白的30%；P-的TCA循环和磷酸戊糖途径通量分别比P+高约60%和80%；进入稳定期时P+有22个反应通量增加（包括PP途径和氨基酸合成），而P-大多数通量下降。
研究结论
在使用现有表达系统时，有利于SOD合成的条件是：1）呼吸发酵代谢期间的活跃生长；2）从生长状态向非生长状态转变的代谢状态。采用非生长关联型启动子并在进入稳定期时表达SOD，可消除部分代谢负担并提高SOD的比生产速率。