Metabolic Engineering of Isoprenoid Biosynthesis in Arabidopsis for the Production of Taxadiene, the First Committed Precursor of Taxol
- 作者
- Óscar Besumbes, Susanna Sauret-Güeto, Michael A. Phillips, Santiago Imperial, Manuel Rodríguez-Concepción, Albert Boronat
- 单位
- Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Química, Universitat de Barcelona, Martí i Franquès 1-7, 08028 Barcelona, Spain
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2004）
- DOI
- 10.1002/bit.20237
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇（Taxol）天然来源有限，难以从红豆杉中大量获取，需开发异源生产体系。本文旨在将紫杉醇生物合成途径的第一步——由GGPP环化生成taxadiene——引入模式植物拟南芥，为后续生产紫杉醇前体奠定基础。
研究策略
从Taxus baccata克隆taxadiene synthase (TXS) cDNA，构建组成型（35S启动子）和地塞米松诱导型（pTA7002）表达载体，转化拟南芥，通过GC-MS检测taxadiene积累，并分析相关表型及色素水平。
研究路线图
核心内容
该研究将红豆杉中编码紫杉二烯合酶的TXS基因克隆并转化至模式植物拟南芥，旨在建立紫杉醇生物合成途径第一步的异源生产体系。作者从Taxus baccata克隆了全长2589 bp的TXS cDNA，所编码蛋白含862个氨基酸残基，截短预测质体转运肽并在大肠杆菌中表达后确认其可催化GGPP生成taxadiene。在拟南芥中，组成型表达全长His标记TXS的7个转基因系中6个检测到目标蛋白，其中C2系幼苗taxadiene积累达23.45±2.76 ng/g干重，但伴随暗下胚轴缩短及叶绿素和类胡萝卜素含量显著下降，说明组成型表达干扰了内源GGPP代谢。相比之下，采用地塞米松诱导型启动子系统（TA:TXS系I2）后，成熟叶片在诱导2天时TXS蛋白达峰值，taxadiene含量高达600 ng/g干重，较组成型表达提升约30倍。该研究首次证明在非红豆杉植物中可实现紫杉醇生物合成途径的功能性第一步，通过诱导性表达可高效利用内源GGPP生成taxadiene，为后续工程化生产紫杉醇类前体及其他异戊二烯化合物提供了可行平台。
创新点
首次在非红豆杉植物中实现紫杉醇生物合成途径的功能性第一步；采用化学诱导型启动子系统使taxadiene产量比组成型表达提高约30倍；通过调控表达时空位置避免内源GGPP代谢紊乱。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Arabidopsis thaliana | 类异戊二烯生物合成（MEP途径提供GGPP） | TXS (taxadiene synthase) | Taxadiene synthase (含RGS(6xH)标签) | 催化 | 组成型(35S)和地塞米松诱导型(pTA7002)表达，全长蛋白靶向质体，催化GGPP环化为taxadiene |
| Escherichia coli | 类异戊二烯生物合成 | TXS (截短形式，缺失预测转运肽) | Taxadiene synthase (C端His标签) | 催化 | 用于验证重组酶活性，与pUBS520-argU共转化，纯化后体外催化GGPP生成taxadiene |
| Taxus baccata | 紫杉醇生物合成 | TXS | Taxadiene synthase | 催化 | 从红豆杉培养细胞克隆cDNA，作为基因来源 |
关键发现
- 克隆了T. baccata TXS cDNA（2589 bp，编码862个残基，98 kDa），截短预测质体转运肽并加C端His标签后在大肠杆菌中有活性，可催化GGPP生成taxadiene。在拟南芥中组成型表达全长His标记TXS，7个转基因系中6个检测到约80 kDa蛋白，其中C2和C3系积累taxadiene约20 ng/g干重（C2幼苗23.45±2.76，C3幼苗19.21±1.31；C2叶片24.64±4.10，C3叶片17.52±0.56 ng/g DW），但伴随暗下胚轴缩短（C2
- 02±1.64 mm，C3
- 77±1.48 mm，对照10.89±2.18 mm）、类胡萝卜素和叶绿素含量显著下降（如叶片叶绿素从对照2.10±0.15降至C2
- 50±0.03、C3
- 58±0.07 mg/g FW）。用地塞米松诱导TA:TXS系I2，成熟叶片中TXS蛋白在诱导2天时达峰值，taxadiene含量高达600 ng/g DW，较组成型表达提高约30倍。
研究结论
本研究证明在非红豆杉植物（拟南芥）中能够实现紫杉醇生物合成途径的关键步骤，通过诱导性表达TXS可高效地将内源GGPP转化为taxadiene，为后续工程化生产紫杉醇类前体及其他GGPP衍生异戊二烯化合物提供了可行平台。