Effect of ArcA and FNR on the Expression of Genes Related to the Oxygen Regulation and the Glycolysis Pathway in Escherichia coli Under Microaerobic Growth Conditions
- 作者
- Sagit Shalel-Levanon, Ka-Yiu San, George N. Bennett
- 单位
- Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University; Department of Bioengineering, Rice University
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2005）
- DOI
- 10.1002/bit.20583
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
微好氧条件下ArcA和FNR对大肠杆菌氧调控和糖酵解途径相关基因表达的影响，以及乳酸通量升高的分子机制。
研究策略
利用野生型、arcA突变体、fnr突变体和arcA/fnr双突变体，在葡萄糖限制恒化器稳态和不同氧浓度（1%-10% OCH）下，通过QRT-PCR测定氧调控、糖酵解、丙酮酸代谢和发酵相关基因的表达水平，并用表达活性FNR突变体的质粒进行验证。
研究路线图
核心内容
本研究利用大肠杆菌MG1655野生型及arcA、fnr、arcA/fnr双突变体，在葡萄糖限制恒化器稳态和1%至10%氧浓度下，通过QRT-PCR定量分析了氧调控、糖酵解及丙酮酸代谢相关基因的表达，并结合表达活性FNR的质粒进行验证，旨在解析微好氧条件下ArcA和FNR对基因表达的独立与协同调控及乳酸通量升高的机制。结果显示，ArcA对fnr表达具有负效应，arcA突变体中fnr表达较野生型最高提升2倍，且arcB、aceE、adhE和ldhA表达分别上调1.6至3.8倍、2.4至5.4倍、2.9至3.5倍和2.2至4.5倍；yfiD在arcA突变体5%氧浓度时高达野生型的7.3倍，但在fnr和双突变体中则降低超过50倍。双突变体中pflB和ackA表达分別下调2.1至2.7倍和4.3至5.9倍。补充实验表明，双突变体携带pRZ7382质粒时fnr表达在10%氧浓度下较野生型高约50倍。这些结果揭示arcA突变体呈现更高水平的活化FNR，可能源于NADH/NAD+比值升高引起的氧化还原状态改变；而双突变体高乳酸通量主要归因于丙酮酸转化为乙酰-CoA的能力下降，并非ldhA表达上调所致。该研究首次定量了两种全局调控因子在微好氧条件下的协同作用，为代谢工程中定向调控氧响应网络提供了分子依据。
创新点
首次定量了微好氧条件下ArcA和FNR对多个基因表达的独立和协同效应；发现ArcA对fnr表达有负效应，arcA突变体中FNR活化形式水平更高；揭示双突变体中乳酸通量升高主要是由于丙酮酸转化为乙酰-CoA能力下降，而非ldhA表达上调。
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 | 氧调控 | fnr | FNR转录调控因子 | 调控 | 在野生型、arcA突变体中表达上调；在fnr突变体和双突变体中缺失 |
| Escherichia coli MG1655 | 氧调控 | arcA | ArcA转录调控因子 | 调控 | 在arcA突变体和双突变体中缺失；表达随氧浓度降低而升高 |
| Escherichia coli MG1655 | 氧调控 | arcB | ArcB传感器组氨酸激酶 | 调控 | 在arcA突变体中表达最高，比野生型高1.6-3.8倍 |
| Escherichia coli MG1655 | 糖酵解 | ptsG | 葡萄糖特异性PTS通透酶 | 转运 | FNR对其有正效应，ArcA无明显作用 |
| Escherichia coli MG1655 | 糖酵解 | pfkA | 6-磷酸果糖激酶1 | 催化 | 在arcA突变体中1%-5% OCH时表达最高；FNR作用不大 |
| Escherichia coli MG1655 | 糖酵解 | pykA | 丙酮酸激酶II | 催化 | FNR强激活，ArcA弱抑制 |
| Escherichia coli MG1655 | 糖酵解 | pykF | 丙酮酸激酶I | 催化 | 在arcA突变体中1%-5% OCH时表达最高；FNR作用不大 |
| Escherichia coli MG1655 | 丙酮酸代谢 | ldhA | D-乳酸脱氢酶 | 催化 | ArcA对其有负效应；arcA突变体和双突变体中比野生型高2.2-4.5倍 |
| Escherichia coli MG1655 | 丙酮酸代谢 | aceE | 丙酮酸脱氢酶E1组分 | 催化 | ArcA和FNR均负调控；arcA突变体中比野生型高2.4-5.4倍 |
| Escherichia coli MG1655 | 丙酮酸代谢 | pflA | 丙酮酸甲酸裂解酶激活酶 | 催化 | 表达不受ArcA和FNR调控 |
| Escherichia coli MG1655 | 丙酮酸代谢 | pflB | 丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | ArcA和FNR均正调控；arcA突变体中最高，双突变体中最低（比野生型低2.1-2.7倍） |
| Escherichia coli MG1655 | 丙酮酸代谢 | pflC | 可能的丙酮酸甲酸裂解酶激活酶2 | 催化 | 表达不受ArcA和FNR调控 |
| Escherichia coli MG1655 | 丙酮酸代谢 | pflD | 甲酸乙酰转移酶2 | 催化 | 表达不受ArcA和FNR调控 |
| Escherichia coli MG1655 | 丙酮酸代谢 | yfiD | 应激诱导的替代丙酮酸甲酸裂解酶亚基 | 催化 | 受FNR正调控；在arcA突变体中5% OCH时比野生型高7.3倍；fnr突变体中降低超50倍 |
| Escherichia coli MG1655 | 发酵途径 | adhE | 乙醇脱氢酶/丙酮酸甲酸裂解酶脱激活酶 | 催化 | 在arcA突变体中1%-5% OCH时比野生型高2.9-3.5倍；FNR影响不大 |
| Escherichia coli MG1655 | 发酵途径 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | FNR有正效应，ArcA无影响 |
| Escherichia coli MG1655 | 发酵途径 | ackA | 乙酸激酶A | 催化 | ArcA和FNR均有正效应；双突变体中比野生型低4.3-5.9倍 |
| Escherichia coli MG1655 | 厌氧呼吸 | frdA | 延胡索酸还原酶黄素蛋白亚基 | 催化 | FNR正调控；arcA突变体在5%和10% OCH时比野生型高1.2和2.7倍 |
关键发现
- ArcA对fnr表达有负效应，arcA突变体中fnr表达比野生型最高高2倍
- arcA突变体中arcB表达比野生型高1.6-3.8倍
- arcA突变体中aceE表达比野生型高2.4-5.4倍，adhE高2.9-3.5倍，pflB高不到2倍
- arcA突变体和双突变体中ldhA表达比野生型高2.2-4.5倍
- yfiD在arcA突变体5% OCH时比野生型高7.3倍
- fnr突变体和双突变体中yfiD表达比野生型低超50倍
- 双突变体中pflB比野生型低2.1-2.7倍，ackA低4.3-5.9倍
- 补充实验显示在双突变体携带pRZ7382质粒时fnr表达极高（10% OCH时与野生型比约50倍）。
研究结论
在arcA突变体中，细胞表现为更高水平的FNR调节蛋白处于活化状态，可能由于高NADH/NAD+比值影响氧化还原状态；双突变体高乳酸通量主要由丙酮酸转化为乙酰-CoA的转化率降低所致。