Identification of Genes Affecting Lycopene Accumulation in Escherichia coli Using a Shot-Gun Method
- 作者
- Min Jung Kang, Young Mi Lee, Sang Hwal Yoon, Jung Heon Kim, So Won Ock, Kyung Hwa Jung, Yong Chul Shin, Jay D. Keasling, Seon Won Kim
- 单位
- Department of Food Science & Nutrition, Gyeongsang National University; Division of Applied Life Science (BK21), Gyeongsang National University; Amicoqen Inc.; Department of Chemical Engineering, University of California Berkeley
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2005）
- DOI
- 10.1002/bit.20539
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在大肠杆菌中通过乌枪法鉴定增强番茄红素积累的基因，特别是寻找除已知的dxs和rpoS之外的新调控基因。
研究策略
构建含番茄红素合成质粒pAC-LYC04的大肠杆菌，转入大肠杆菌基因组文库，通过颜色筛选红色加深的克隆，对阳性克隆进行基因鉴定和功能验证。
研究路线图
核心内容
该研究采用乌枪法在大肠杆菌中鉴定增强番茄红素积累的新基因。作者构建了含有番茄红素合成质粒pAC-LYC04的菌株，转入宿主基因组文库，通过红色加深表型筛选阳性克隆，并结合BLAST鉴定及功能验证，最终从6个阳性克隆中锁定dxs、appY、crl和rpoS四个关键基因，其中appY和crl为首次报道。实验表明，单独表达appY或dxs可将番茄红素产量提升至2.8 mg/g DCW，而空载体对照仅为0.6 mg/g DCW；dxs与appY共表达时产量达4.7 mg/g DCW，约为对照的8倍，较单独表达dxs（2.7 mg/g DCW）提高约74%。此外，dxs与crl、rpoS的组合也均高于单独dxs。对照实验确认phoE基因无增效作用，排除其干扰。该研究建立的基于颜色筛选的乌枪法基因鉴定体系，不仅揭示了大肠杆菌中调控番茄红素积累的新转录因子，也提示这些调控基因的过表达可普遍增强工程化大肠杆菌中类胡萝卜素的合成效率。
创新点
首次发现appY和crl基因可增强番茄红素生产；证明dxs与appY协同表达显著提高产量；建立了基于颜色筛选的乌枪法基因鉴定系统。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素生物合成通路 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶 (DXP synthase) | 催化 | MEP途径第一步的限速酶，催化甘油醛-3-磷酸和丙酮酸缩合形成DXP |
| Escherichia coli DH5α | 厌氧能量代谢调控 | appY | AppY转录激活因子 | 调控 | 激活hya和cbdAB-appA操纵子，与能量代谢相关；非番茄红素合成直接相关 |
| Escherichia coli DH5α | curli表面纤维形成与RpoS活性调控 | crl | Crl转录调控因子 | 调控 | 激活csgBA基因，并刺激RpoS活性；可能通过疏水相互作用促进番茄红素积累 |
| Escherichia coli DH5α | 稳定期/应激响应调控 | rpoS | RNA聚合酶sigma S (sigma38)因子 | 调控 | 调控稳定期基因转录，增强番茄红素合成酶表达或提高细胞抗逆性 |
| Escherichia coli DH5α | 外膜通透性 | phoE | 外膜孔蛋白E (PhoE) | 转运 | 小分子被动扩散孔道，实验证实对番茄红素生产无影响 |
| Escherichia coli DH5α | 番茄红素外源合成通路 | crtE, crtB, crtI | GGPP合酶、八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 由pAC-LYC04质粒携带，来源于Erwinia herbicola，负责将IPP/FPP转化为番茄红素 |
| Escherichia coli DH5α | IPP/DMAPP异构化 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 (IPP isomerase) | 催化 | 来自Haematococcus pluvialis，已包含在pAC-LYC04中，因此未在筛选中出现 |
| Escherichia coli DH5α | 半乳糖酸代谢 | dgoK, dgoR | 2-氧代-3-脱氧半乳糖酸激酶、半乳糖酸利用转录抑制因子 | 催化 | 单独克隆无增强效果，H90克隆的增强效应可能涉及多个基因协同 |
| Escherichia coli DH5α | 未知功能 | ycgZ, ymgA, ymgB | 假定蛋白 | 调控 | H72克隆中三个假定蛋白基因，单独表达无效果，可能协同作用；ymgA过表达导致粘液形成 |
关键发现
['从基因组文库筛选中获得6个阳性克隆（L4, H36, H39, H70, H72, H90），共含13个基因。', '通过BLAST鉴定，dxs、appY、crl和rpoS是增强番茄红素生产的主要基因，其中appY和crl为新发现。', '单独表达appY或dxs均可使番茄红素产量达2.8 mg/g DCW，而空载体对照仅0.6 mg/g DCW。', 'dxs与appY共表达产生4.7 mg/g DCW，是双基因均未表达时（0.6 mg/g DCW）的约8倍，比单独dxs（2.7 mg/g DCW）提高约74%。', 'dxs与crl、rpoS、appY的组合分别产生3.1、3.5、4.7 mg/g DCW，均高于单独dxs。', 'rpoS失活曾报道使类胡萝卜素形成减少85%，本研究表明其过表达可增强番茄红素积累。', 'phoE基因单独表达对番茄红素产量无影响（0.7 mg/g DCW），确认L4克隆的增强效应来自crl。', 'pBAD-H36（含appY）产量为1.7 mg/g DCW，pBAD-L4为1.5 mg/g DCW，均高于对照0.5 mg/g DCW。']
研究结论
通过乌枪法成功鉴定出dxs、crl、rpoS和appY四个基因能增强大肠杆菌的番茄红素积累，其中crl和appY为新发现的调控基因。dxs与appY共表达可协同提高产量至4.7 mg/g DCW。这些调控基因的过表达有望增强所有在大肠杆菌中工程化的类胡萝卜素产量。