Terpenoid Indole Alkaloid Production by Catharanthus roseus Hairy Roots Induced by Agrobacterium tumefaciens Harboring rol ABC Genes
- 作者
- Seung-Beom Hong, Christie A.M. Peebles, Jacqueline V. Shanks, Ka-Yiu San, Susan I. Gibson
- 单位
- Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University; Departments of Chemical Engineering and Bioengineering, Rice University; Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University; Department of Plant Biology, University of Minnesota
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2005）
- DOI
- 10.1002/bit.20699
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
传统发根农杆菌诱导的长春花毛状根存在冠瘿碱合成、液体培养适应性差、易形成愈伤组织等问题，影响次生代谢产物稳定生产。本文旨在利用rol ABC基因诱导高质量毛状根，并评估其生长和萜类吲哚生物碱积累特性。
研究策略
将来自农杆菌Ri质粒T_L-DNA的rol ABC基因克隆到pPZP200二元载体构建pPZPROL，转化去武装的农杆菌GV3101，感染长春花植株获得rol ABC毛状根；与常规A. rhizogenes 15834诱导的野生型毛状根在生长形态、冠瘿碱合成、生物碱积累等方面进行比较。
核心内容
本研究利用携带rol ABC基因的根癌农杆菌GV3101感染长春花，以毛状根表型作为直接选择标记，建立了无抗生素筛选、无冠瘿碱合成的毛状根培养体系。与常规发根农杆菌15834诱导的野生型毛状根相比，rol ABC毛状根在液体培养基中适应性良好，未形成愈伤组织，且连续传代两年表型稳定。总生物碱含量为5.9–6.4 mg/g DW，与野生型（4.3–6.6 mg/g DW）相当，但各株系间含量高度一致，而野生型株系间变异较大。在生物碱组成上，仅hoerhamnicine含量在指数中期和后期与野生型存在显著差异（P=0.012和P=0.016），个别株系如rol ABC11后期tabersonine和lochnericine产量降至中期的一半。PCR证实rol ABC株系缺乏ags基因，不产生甘露碱和农杆碱。该体系证明了rol ABC三个基因足以诱导高质量长春花毛状根，为后续萜类吲哚生物碱的代谢工程改造提供了无需标记、表型可选的优良底盘。
创新点
['使用rol ABC基因作为直接选择标记，无需抗生素筛选即可获得转基因毛状根', 'rol ABC毛状根不产生冠瘿碱（甘露碱和农杆碱），液体培养基适应性好，不形成愈伤组织', '证明rol ABC三个基因足以诱导长春花高质量毛状根', '建立无标记、表型可选的毛状根体系，便于后续代谢工程操作']
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus (cv. Little Bright Eye) 毛状根 | 萜类吲哚生物碱生物合成 | rolA, rolB, rolC | RolA, RolB, RolC | 调控 | 来自农杆菌pRiA4质粒T_L-DNA，诱导毛状根形成并增强生长素敏感性，作为直接选择标记 |
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | — | — | — | 调控 | 去武装农杆菌菌株，携带pPZPROL载体用于植物转化 |
| Catharanthus roseus hairy root | 萜类吲哚生物碱生物合成 | ags | agropine synthase | 催化 | 农杆菌Ri质粒T_R-DNA上的农杆碱合成酶基因，用于PCR检测以区分T_R-DNA存在与否 |
| E. coli | — | — | — | 调控 | 用于繁殖pPCV002-ABC质粒的宿主菌 |
关键发现
- rol ABC毛状根总生物碱含量为5.9-6.4 mg/g DW，与野生型毛状根（4.3-6.6 mg/g DW）相当
- rol ABC各系总生物碱含量非常一致（约6.0 mg/g DW），而野生型系间变异较大。在指数中期和后期，rol ABC与野生型仅在hoerhamnicine含量上存在显著差异（中期P=0.012，后期P=0.016）。例外的是rol ABC11系，其后期tabersonine和lochnericine特异产量约为中期的一半。rol ABC系均不产生甘露碱和农杆碱，PCR证实缺乏ags基因
- 野生型中部分系产生冠瘿碱。转化效率方面，约50株长春花感染后获得11个毛状根，低于15834的60%。rol ABC毛状根在连续传代2年内表型稳定。
研究结论
rol ABC基因足以诱导长春花产生高质量毛状根，其液体适应性优于野生型毛状根，不产生冠瘿碱，总生物碱积累与野生型相当。利用pPZPROL载体可直接以毛状根表型作为选择标记，获得无标记转基因毛状根，为长春花次生代谢产物的代谢工程提供了优良的底盘体系。