Microbial Synthesis of Triacetic Acid Lactone
- 作者
- Dongming Xie, Zengyi Shao, Jihane Achkar, Wenjuan Zha, John W. Frost, Huimin Zhao
- 单位
- Department of Chemistry, Michigan State University; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2005）
- DOI
- 10.1002/bit.20759
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从葡萄糖直接微生物合成三乙酸内酯（TAL），并评估天然酶和工程突变体的效果，以确定最佳宿主和酶。
研究策略
在E. coli和S. cerevisiae中异源表达Gerbera hybrida的g2ps1基因编码的2-吡喃酮合酶，并比较不同启动子；同时通过理性设计对Brevibacterium ammoniagenes的脂肪酸合酶B（FAS-B）和Penicillium patulum的6-甲基水杨酸合酶（6-MSAS）的酮还原酶结构域进行点突变，创建具有TAL合成活性的突变体，并在发酵罐控制条件下比较各菌株的TAL产量。
核心内容
该研究旨在实现从葡萄糖直接微生物合成三乙酸内酯（TAL），通过异源表达和酶工程改造确定最佳宿主与酶策略。研究在E. coli和S. cerevisiae中表达Gerbera hybrida的g2ps1基因编码的2-吡喃酮合酶（2-PS），并比较不同启动子；同时理性设计Brevibacterium ammoniagenes脂肪酸合酶B（FAS-B）和Penicillium patulum的6-甲基水杨酸合酶（6-MSAS）的酮还原酶结构域突变体。结果显示，E. coli中TAL产量为0.23-0.47 g/L，而S. cerevisiae中ADH2启动子驱动的2-PS产量达0.37 g/L，比活较E. coli高5倍。在S. cerevisiae中，表达Y1572F 6-MSAS突变体的菌株产量最高，达1.8 g/L TAL（产率6%），比表达天然2-PS的菌株浓度高5倍、产率高10倍，比三突变体G1419A-G1421P-G1424A 6-MSAS高20倍以上。研究表明，突变酮还原酶活性位点酪氨酸（Y1572F）比修饰Rossman折叠更有效地消除竞争性还原活性，是实现TAL高效合成的最佳策略，为聚酮类化合物的微生物生产提供了新思路。
创新点
['首次在完整微生物中证明g2ps1编码的2-PS可实现TAL的合成与积累', '系统比较了不同启动子对TAL合成的影响，确定ADH2启动子最优', '构建了Y1572F 6-MSAS突变体，其TAL产量显著高于天然2-PS和其他突变体', '证明了突变酮还原酶活性位点酪氨酸比修饰Rossman折叠更有效地消除酮还原酶活性，从而获得更高TAL合成']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JWF1(DE3) | 三乙酸内酯生物合成 | g2ps1 | 2-吡喃酮合酶（2-PS） | 催化 | 来自Gerbera hybrida的天然TAL合成酶 |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 三乙酸内酯生物合成 | g2ps1 | 2-吡喃酮合酶（2-PS） | 催化 | 使用ADH2启动子表达，比E. coli中表达水平高5倍 |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 脂肪酸合成 | fasB（Y2226F突变） | 脂肪酸合酶B突变体（Y2226F） | 催化 | 突变消除了酮还原酶活性，产生TAL |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 聚酮合成（6-甲基水杨酸合成） | 6-MSAS（Y1572F突变） | 6-甲基水杨酸合酶突变体（Y1572F） | 催化 | 最高TAL生产者，浓度1.8 g/L，产率6% |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 聚酮合成（6-甲基水杨酸合成） | 6-MSAS（G1419A-G1421P-G1424A突变） | 6-甲基水杨酸合酶三突变体 | 催化 | 通过修饰Rossman折叠消除酮还原酶活性，但效果差 |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 磷酸泛酰巯基乙胺转移酶辅助 | ppt1 | 磷酸泛酰巯基乙胺转移酶 | 催化 | 来自Brevibacterium ammoniagenes，用于激活Y2226F FAS-B |
| Saccharomyces cerevisiae INVSc1 | 磷酸泛酰巯基乙胺转移酶辅助 | sfp | 磷酸泛酰巯基乙胺转移酶 | 催化 | 来自Bacillus subtilis，用于激活6-MSAS突变体 |
关键发现
- 在E. coli中表达g2ps1，葡萄糖丰富和限制条件下分别产生0.23 g/L和0.47 g/L TAL，产率分别为0.08%和0.4%
- 在S. cerevisiae中，ADH2启动子驱动的g2ps1表达产生0.37 g/L TAL（产率0.7%），且2-PS比活比E. coli高5倍（0.036 vs 0.007 μmol/min/mg）
- 比较四种S. cerevisiae菌株，表达Y1572F 6-MSAS的菌株产生最高TAL浓度1.8 g/L和产率6%，比表达G1419A-G1421P-G1424A 6-MSAS的菌株高20倍以上，比表达天然2-PS的菌株高5倍浓度和10倍产率
- Y2226F FAS-B菌株产生0.10 g/L TAL（产率0.6%）
- G1419A-G1421P-G1424A 6-MSAS菌株仅产生0.08 g/L（产率0.5%）。
研究结论
在S. cerevisiae中，表达Y1572F 6-MSAS突变体是合成TAL最有效的策略，其浓度和产率显著高于天然2-PS及其他突变体。突变酮还原酶活性位点的酪氨酸残基比修饰NADPH结合域（Rossman折叠）更有效地实现TAL合成。