Anaerobic Fermentation of Glycerol by Escherichia coli: A New Platform for Metabolic Engineering
- 作者
- Yandi Dharmadi, Abhishek Murarka, Ramon Gonzalez
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Rice University
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2006）
- DOI
- 10.1002/bit.21025
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
生物柴油生产产生大量副产甘油，价格低廉且过剩，但大肠杆菌传统上被认为不能在无外部电子受体时发酵甘油，急需开发甘油发酵平台以利用这一丰富的碳源。
研究策略
通过pH调控、基因敲除（hycB、mgsA、trkA）以及气体环境（氩气、CO2、氢气累积）的调控，结合HPLC和NMR分析，阐明甘油发酵的机制及其对CO2的依赖，并验证在酸性pH和CO2存在下可实现高效发酵。
核心内容
该研究以生物柴油副产甘油为碳源，构建了大肠杆菌厌氧发酵平台。传统观点认为大肠杆菌无法在无外部电子受体时发酵甘油，但该工作发现该过程呈pH依赖性：在pH 6条件下，初始10 g/L甘油中有约9 g/L被发酵，最大细胞浓度达486.2 mg/L，而pH 8时仅约1 g/L被利用。发酵产物中乙醇和琥珀酸合计占总产物摩尔数的93%，碳回收率达95%。机制研究表明，甲酸氢裂解酶（FHL）氧化甲酸产生的CO2是甘油发酵所必需，FHL缺陷菌株发酵严重受损，而外部补充CO2可部分恢复；氢气则对细胞生长和甘油发酵有抑制作用。在CO2气氛下，琥珀酸占比从7%提升至22%，产量增加三倍以上。此外，玉米浆可作为低成本营养补充剂，支持大肠杆菌B在5 g/L玉米浆下发酵6.78 g/L甘油。该工作确立了甘油作为高还原性廉价碳源厌氧生产乙醇、琥珀酸等还原性化学品的可行性，为建立基于大肠杆菌的甘油代谢工程平台奠定了基础。
创新点
发现大肠杆菌能以pH依赖方式厌氧发酵甘油；证明甲酸氢裂解酶（FHL）氧化甲酸产生的CO2是甘油发酵所必需；发现H2对细胞生长和甘油发酵有负面影响；证明玉米浆（corn steep liquor）可作为低成本营养补充剂支持甘油发酵。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 | 甘油发酵/甲酸代谢 | hycB | 氢酶3亚基（Hyd-3） | 催化 | FHL复合物组分，其缺失导致甘油发酵严重受损（图5）。 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲酸代谢 | fdhF, hycB | 甲酸氢裂解酶复合物（FHL） | 催化 | 催化甲酸氧化为CO2和H2，CO2对甘油发酵至关重要。 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲基乙二醛代谢 | mgsA | 甲基乙二醛合酶（MGS） | 催化 | 碱性pH下MGS缺失不能恢复甘油发酵，排除甲基乙二醛毒性假说。 |
| Escherichia coli MG1655 | 钾离子转运 | trkA | TrkA钾转运系统 | 转运 | 缺失不影响甘油发酵，排除FHL介导的质子-钾交换耦联假说。 |
| Escherichia coli MG1655 | 甘油分解代谢 | gldA | NAD+依赖性甘油脱氢酶 | 催化 | 替代途径，不参与主要发酵过程。 |
| Escherichia coli MG1655 | 甘油分解代谢 | glpD | 需氧甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 需氧条件下使用，不参与厌氧发酵。 |
| Escherichia coli MG1655 | 甘油分解代谢 | glpABC | 厌氧甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 需电子受体（如富马酸、硝酸盐）参与呼吸作用。 |
| Escherichia coli MG1655 | 丙酮酸代谢 | pfl | 丙酮酸甲酸裂解酶（PFL） | 催化 | 催化丙酮酸生成甲酸和乙酰辅酶A，是甲酸产生的关键酶。 |
| Escherichia coli MG1655 | CO2代谢 | can | 碳酸酐酶 | 催化 | 催化CO2与HCO3-相互转化，影响CO2可利用性。 |
| Escherichia coli MG1655 | 琥珀酸合成 | frd | 富马酸还原酶 | 催化 | 催化富马酸还原为琥珀酸，可产生质子动势。 |
关键发现
- pH 6时约9 g/L甘油被发酵（初始10 g/L），最大细胞浓度486.2 mg/L
- pH 8时仅约1 g/L甘油被发酵。乙醇和琥珀酸占发酵产物总量（摩尔计）的93%（乙醇86%、琥珀酸7%），碳回收率达95%。在CO2气氛下，琥珀酸占比从7%提高至22%（增产3倍以上）。FHL缺陷菌株（MG1655hycB::）甘油发酵严重受损，外部补充CO2可部分恢复其发酵能力。E. coli W3110在10 g/L tryptone下发酵8.42 g/L甘油
- E. coli B在5 g/L玉米浆下发酵6.78 g/L甘油。
研究结论
大肠杆菌在酸性pH条件下能够有效厌氧发酵甘油，该过程依赖于FHL氧化甲酸产生的CO2，而H2则起负面作用。甘油作为高还原性、廉价的碳源，可用于厌氧生产乙醇、琥珀酸等还原性化学品，为建立基于大肠杆菌的代谢工程平台提供了基础。