Effects of Terpenoid Precursor Feeding on Catharanthus roseus Hairy Roots Over-Expressing the Alpha or the Alpha and Beta Subunits of Anthranilate Synthase
- 作者
- Christie A.M. Peebles, Seung-Beom Hong, Susan I. Gibson, Jacqueline V. Shanks, Ka-Yiu San
- 单位
- Department of Bioengineering, Rice University; Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University; Department of Plant Biology, University of Minnesota; Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University; Department of Chemical and Bimolecular Engineering, Rice University
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2005）
- DOI
- 10.1002/bit.20739
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
长春花毛状根中萜类吲哚生物碱（TIA）产量极低，尤其是抗肿瘤药物长春碱和长春新碱含量微小，限制了商业化生产。需要确定TIA生物合成途径中的限制性环节，并探索通过前体饲喂和基因过表达提高产量的策略。
研究策略
利用糖皮质激素诱导型启动子过表达拟南芥来源的反馈抑制抗性邻氨基苯甲酸合酶α亚基（ASα），或同时组成型过表达β亚基（ASαβ），并在指数生长后期向培养物饲喂萜类前体（1-脱氧-D-木酮糖、马钱苷、断马钱苷），通过HPLC分析毛状根内色氨酸、色胺及多种TIA的积累变化。
研究路线图
核心内容
该研究以长春花毛状根为对象，探讨萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成的限制环节及提升策略。实验采用糖皮质激素诱导型启动子过表达拟南芥来源的反馈抑制抗性邻氨基苯甲酸合酶α亚基（ASα），或同时组成型过表达β亚基（ASαβ），并在指数生长后期饲喂萜类前体（1-脱氧-D-木酮糖、马钱苷、断马钱苷），通过HPLC分析色氨酸、色胺及多种TIA的积累变化。结果显示，在ASα毛状根中，饲喂1-脱氧-D-木酮糖使诱导样品的hörhammericine含量增加125%，饲喂马钱苷使catharanthine增加45%；在ASαβ毛状根中，饲喂马钱苷使诱导样品的catharanthine、ajmalicine、lochnericine和tabersonine分别增加26%、84%、119%和225%。此外，ASαβ在0.2μM地塞米松诱导下比ASα在3μM诱导下产生更大的色氨酸和色胺池。研究表明，萜类途径而非吲哚途径是TIA通量的主要瓶颈，DXS和G10H可能是关键酶，未来代谢工程需同时增强萜类和吲哚两条途径的通量。
创新点
首次系统比较了过表达ASα与ASαβ的C. roseus毛状根在不同萜类前体饲喂下的TIA产物谱差异；揭示了萜类途径而非吲哚途径是限制TIA通量的主要瓶颈，并提出DXS和G10H为潜在关键酶。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus 毛状根（hairy root） | 萜类吲哚生物碱（TIA）合成通路 | — | — | — | 宿主体系，为EHIASA-1（ASα）和ASAB-1（ASαβ）两个转基因毛状根系 |
| Catharanthus roseus 毛状根 | 色氨酸生物合成（邻氨基苯甲酸合酶途径） | ASα（拟南芥突变体，反馈抑制抗性） | 邻氨基苯甲酸合酶α亚基 | 催化 | 催化分支酸转化为邻氨基苯甲酸；在EHIASA-1和ASAB-1中由糖皮质激素诱导型启动子控制表达 |
| Catharanthus roseus 毛状根 | 色氨酸生物合成（邻氨基苯甲酸合酶途径） | ASβ（拟南芥） | 邻氨基苯甲酸合酶β亚基 | 催化 | 提供谷氨酰胺的氨基基团；在ASAB-1中由组成型CaMV 35S启动子控制表达 |
关键发现
- 在ASα毛状根中，饲喂1-脱氧-D-木酮糖使诱导样品中hörhammericine含量增加125%
- 饲喂马钱苷使诱导样品中catharanthine增加45%。在ASαβ毛状根中，饲喂马钱苷使诱导样品中catharanthine增加26%、ajmalicine增加84%、lochnericine增加119%、tabersonine增加225%。饲喂马钱苷显著降低ASα诱导样品的色氨酸和色胺池（P≤0.05），但显著增加ASαβ诱导样品的色氨酸（P≤0.05）和色胺（P≤0.11）。ASαβ在0.2μM地塞米松诱导下比ASα在3μM诱导下产生更大的色氨酸和色胺池。断马钱苷饲喂显著增加未诱导ASαβ样品的catharanthine、ajmalicine、lochnericine和tabersonine，但对诱导样品无显著效果。
研究结论
萜类途径是C. roseus毛状根中TIA生物合成的限制因素，萜类前体（尤其是马钱苷）与ASαβ过表达的组合可显著促进下游TIA积累。1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS）和香叶醇-10-羟化酶（G10H）可能是萜类途径中的关键瓶颈，未来代谢工程应同时增强萜类和吲哚两条途径的通量。