High-Level Production of Amorpha-4,11-Diene in a Two-Phase Partitioning Bioreactor of Metabolically Engineered Escherichia coli
- 作者
- Jack D. Newman, Jessica Marshall, Michelle Chang, Farnaz Nowroozi, Eric Paradise, Douglas Pitera, Karyn L. Newman, Jay D. Keasling
- 单位
- Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley; Department of Bioengineering, University of California, Berkeley; California Institute of Quantitative Biomedical Research, University of California, Berkeley; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; Berkeley Center for Synthetic Biology, University of California
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2006）
- DOI
- 10.1002/bit.21017
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
amorpha-4,11-diene（青蒿素前体）在大肠杆菌发酵中因挥发导致产量严重低估，且产量受碳源和营养限制，需要建立有效的捕获和补料策略以实现高产。
研究策略
构建含九基因异源甲羟戊酸途径的大肠杆菌（APM），采用正十二烷有机相的两相分配生物反应器原位捕获挥发性amorpha-4,11-diene，并通过补加甘油和复杂营养物（酵母提取物/胰蛋白胨）解除营养限制，同时利用冷凝器从尾气中回收纯化产品。
核心内容
该研究针对大肠杆菌发酵生产青蒿素前体amorpha-4,11-diene时因挥发导致产量低估和营养限制的问题，构建了含九基因异源甲羟戊酸途径的工程菌APM，并设计了正十二烷有机相覆盖的两相分配生物反应器原位捕获挥发性产物，同时补加甘油和酵母提取物/胰蛋白胨解除营养限制，尾气经冷凝器回收纯化产品。研究发现该萜烯在生物反应器中半衰期约50分钟，两相系统使检测产量提高8.5倍，摇瓶中从33.3 mg/L增至281.4 mg/L；补料后产量达0.48 g/L，且主要积累发生在细胞停止生长后。利用产物的挥发特性，通过冷凝器一步获得纯度89%的产品，并以此纯品制备标准曲线，发现此前用石竹烯为标准导致产量高估约30%。超过97%的产物富集于有机相。该两相分配补料策略有效解决了挥发性萜烯的捕获和营养限制问题，使产量达到当时异源萜烯的最高报道水平，同时为产物回收和定量校正提供了简便方法。
创新点
首次定量证明amorpha-4,11-diene在生物反应器中通过空气吹扫快速挥发（半衰期约50分钟）；利用正十二烷两相体系有效捕获产品，使检测产量提高8.5倍；通过补料使产量提高约20倍至约0.5 g/L；利用挥发特性通过冷凝器一步获得纯度89%的产品，并制备真实标准品校正了此前用石竹烯标准高估30%的问题。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli W3110 | 甲羟戊酸途径 | atoB | 乙酰辅酶A乙酰转移酶 | 催化 | 质粒pMevT，催化乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A |
| Escherichia coli W3110 | 甲羟戊酸途径 | HMGS | 羟甲基戊二酰辅酶A合酶 | 催化 | 质粒pMevT，催化乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合为HMG-CoA |
| Escherichia coli W3110 | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（截短型） | 催化 | 质粒pMevT，催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸 |
| Escherichia coli W3110 | 甲羟戊酸途径 | MK | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 质粒pMBIS，催化甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸 |
| Escherichia coli W3110 | 甲羟戊酸途径 | PMK | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 质粒pMBIS，催化甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸 |
| Escherichia coli W3110 | 甲羟戊酸途径 | MPD | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 | 催化 | 质粒pMBIS，催化甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧为异戊烯基焦磷酸（IPP） |
| Escherichia coli W3110 | 甲羟戊酸途径/异戊烯基焦磷酸代谢 | idi | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 质粒pMBIS，催化IPP异构为二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP） |
| Escherichia coli W3110 | 甲羟戊酸途径/法尼基焦磷酸合成 | ispA | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 质粒pMBIS，催化IPP和DMAPP缩合生成法尼基焦磷酸（FPP） |
| Escherichia coli W3110 | amorpha-4,11-diene合成 | ADS | amorpha-4,11-diene合酶（合成型基因） | 催化 | 质粒pADS，催化FPP环化为amorpha-4,11-diene |
关键发现
- amorpha-4,11-diene在无细胞生物反应器中呈一级降解动力学，半衰期约50分钟；摇瓶培养中，添加正十二烷覆盖的培养检测到281.4 mg/L ±
- 4（SD）amorpha-4,11-diene，而无覆盖的培养仅33.3 mg/L ±
- 3，提高8.5倍；两相生物反应器中补加甘油和营养物后产量达0.48 g/L（约0.5 g/L），相比未补料提高约2倍且主要在细胞停止生长后增加；从尾气冷凝获得的产品经GC-MS测定纯度为89%，与文献报道的体外amorpha-4,11-diene合酶产物91%一致；用纯化产品制作标准曲线发现以石竹烯为标准时产量被高估约30%；大于97%的amorpha-4,11-diene位于正十二烷有机相，第二级冷阱捕获的产品不到总回收量的1%。
研究结论
两相分配生物反应器可有效捕获挥发性萜烯，结合补充碳源和营养物，工程化大肠杆菌异源表达酵母甲羟戊酸途径和密码子优化的amorpha-4,11-diene合酶，产量可达约0.4 g/L（30小时标准培养基），为当时异源萜烯产物的最高报道。同时，产品挥发特性可用于简化产物回收和纯化，并利用纯品校正产量测定。