Efficient Regeneration of NADPH Using an Engineered Phosphate Dehydrogenase
- 作者
- Tyler W. Johannes, Ryan D. Woodyer, Huimin Zhao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign; Department of Chemistry, University of Illinois at Urbana-Champaign
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2006）
- DOI
- 10.1002/bit.21168
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
NADPH辅酶价格昂贵，需原位再生，而现有FDH系统对NADPH再生的效率不高，缺乏高效稳定的NADPH再生酶
研究策略
结合理性设计与定向进化，将辅酶特异性突变A176R引入热稳定PTDH突变体12x，获得高活性高稳定性的NADP+特异性12x-A176R突变体，并与木糖还原酶或醇脱氢酶偶联，在酶膜反应器中实现NADPH再生和产物连续合成
研究路线图
核心内容
本研究针对NADPH辅酶价格昂贵、现有甲酸脱氢酶（FDH）再生效率低的问题，将理性设计与定向进化结合，在热稳定磷酸脱氢酶（PTDH）突变体12x中引入辅酶特异性突变A176R，获得高活性且高稳定性的NADP⁺特异性突变体12x-A176R。该酶对NADP⁺的kcat/KM达14.9 mM⁻¹min⁻¹，比野生型PTDH高约440倍，比商业化mut Pse-FDH高约65倍，且在40% DMSO中孵育10小时活性完全保留。将该酶与木糖还原酶或醇脱氢酶偶联，在酶膜反应器中连续合成(R)-苯乙醇和木糖醇：批式合成(R)-苯乙醇40分钟达到100%转化，产率88 g/L/d；连续生产时平均转化率98%，时空产率14 g/L/d，均优于mut Pse-FDH。生产木糖醇时，采用带电纳滤膜提高辅酶保留，时空产率达230 g/L/d、总转化数（TTN）达2630，为现存生物法最高水平。结果表明12x-A176R是高效稳定的NADPH再生酶，具备广阔工业应用前景。
创新点
1. 12x-A176R突变体兼具热稳定性和高NADP+活性；2. 在酶膜反应器中连续生产(R)-苯乙醇和木糖醇，时空产率显著高于商业化mut Pse-FDH；3. 采用带电纳滤膜提高辅酶保留，使木糖醇时空产率达230 g/L/d
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 蛋白异源表达 | ptdh (12x-A176R) | 磷酸脱氢酶 12x-A176R PTDH | 催化 | 来自Pseudomonas stutzeri，经定向进化与理性设计组合获得，用于NADPH再生 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 蛋白异源表达 | fdh (mut Pse-FDH) | NADP+特异性甲酸脱氢酶 mut Pse-FDH | 催化 | 来自Pseudomonas sp. 101，商业化的NADPH再生酶，作为对照 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 木糖醇合成 | xyl1 (ncXR) | 木糖还原酶 ncXR | 催化 | 来自Neurospora crassa，催化D-木糖还原为木糖醇，需NADPH |
| 无（体外酶膜反应器） | (R)-苯乙醇合成 | adh (ADH-LB) | 醇脱氢酶 ADH-LB | 催化 | 来自Lactobacillus brevis，催化苯乙酮还原为(R)-苯乙醇，需NADPH |
关键发现
- 12x-A176R对NADP+的kcat/KM为14.9 mM^-1 min^-1，比野生型PTDH高约440倍，比mut Pse-FDH高约65倍
- KM(NADP+)为5.5 μM，KM(亚磷酸盐)为36 μM
- 在40% DMSO中孵育10 h完全保留活性，而野生型PTDH基本失活
- 批式合成(R)-苯乙醇时，12x-A176R的速率比野生型PTDH快1.8倍，比mut Pse-FDH快2.2倍，40 min达到100%转化，产率88 g/L/d，TTN为100
- 连续EMR生产(R)-苯乙醇时，平均转化率98%（mut Pse-FDH为70%），时空产率14 g/L/d（mut Pse-FDH为10 g/L/d），TTN为100（mut Pse-FDH为70）
- 连续EMR生产木糖醇（YM3膜）时，时空产率190 g/L/d（mut Pse-FDH仅48 g/L/d），TTN为617（mut Pse-FDH为154）
- 改用NTR 7410带电纳滤膜后，木糖醇时空产率提高至230 g/L/d，TTN达2,630，产物浓度40 g/L
研究结论
12x-A176R突变体PTDH是高效、稳定的NADPH再生酶，在酶膜反应器中生产(R)-苯乙醇和木糖醇时性能优于商业化mut Pse-FDH，木糖醇时空产率230 g/L/d为现存生物法最高水平，具有广阔应用前景