Metabolic Engineering of Sesquiterpene Metabolism in Yeast
- 作者
- Shunji Takahashi, Yunsoo Yeo, Bryan T. Greenhagen, Tom McMullin, Linsheng Song, Julie Maurina-Brunker, Reinhardt Rosson, Joseph P. Noel, Joe Chappell
- 单位
- Department of Plant & Soil Sciences, University of Kentucky, Lexington, Kentucky; Bio-Technical Resources, Manitowoc, Wisconsin; Howard Hughes Medical Institute, The Jack H. Skirball Center for Chemical Biology and Proteomics, The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, California
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2007）
- DOI
- 10.1002/bit.21216
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
倍半萜类化合物在天然来源中含量低、成分复杂，化学合成困难，缺乏高效、可扩展的生产平台，需要工程化酵母实现高产量倍半萜烃及其羟基化衍生物的生产。
研究策略
通过在酿酒酵母中引入erg9（鲨烯合酶）和dpp1（磷酸酶）敲除突变、sue突变（有氧甾醇摄取）以及过表达截短的HMG2（HMGR催化域）来增强甲羟戊酸途径通量，积累高水平的法尼基二磷酸（FPP）；随后共表达不同倍半萜合酶基因（TEAS、HPS、CVS）将FPP转化为倍半萜烃，并共表达细胞色素P450羟化酶（EAH）和细胞色素P450还原酶（P450R）实现烃的羟基化。
核心内容
该研究以酿酒酵母为底盘，通过系统代谢工程构建了高产倍半萜及其羟基化衍生物的平台。研究者首先在WAT11菌株中引入ERG9和DPP1基因敲除、sue突变以及截短HMG2的过表达，增强甲羟戊酸途径通量以实现法尼基二磷酸（FPP）的高水平积累。随后分别表达三种倍半萜合酶基因（TEAS、HPS、CVS）将FPP转化为对应烃类产物，并进一步共表达细胞色素P450羟化酶（EAH）及其还原酶（P450R）完成烃的羟基化。关键结果表明，启动子选择对产量影响显著，TEAS在GAL10启动子下仅产1.2 μg/L产物，改用ADH1启动子后提高至230 μg/L；在优化的SW24菌株中，5-表-马兜铃烯和prennaspirodiene产量均达到约90 mg/L。共表达EAH与P450R后，羟基化产物cap-sidiol积累超过50 mg/L，同时烃类维持在40–50 mg/L，实现了合酶与羟化酶的高效偶联。该研究证明了工程化酵母可作为倍半萜高效生产的可行平台，为高价值萜类化合物的工业化制备和酶催化偶联机制研究奠定了基础。
创新点
构建了多种FPP高积累的酵母工程菌株（SW24、CALI5-1、CALI7-1），实现了超过90 mg/L的倍半萜烃产量；首次在酵母中实现了倍半萜合酶与P450羟化酶的高效偶联，使烃和羟基化产物各达约50 mg/L；阐明了基因表达载体设计和基因排列对偶联效率的影响。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 倍半萜生物合成 | TEAS | 5-表-马兜铃烯合酶 | 催化 | 初始评估：GAL10启动子下产量1.2 μg/L，ADH1启动子下230 μg/L |
| Saccharomyces cerevisiae SW24 | 甲羟戊酸途径 | ERG9 | 鲨烯合酶 | 催化 | 敲除突变，阻断鲨烯合成，促进FPP积累 |
| Saccharomyces cerevisiae SW24 | 甲羟戊酸途径 | DPP1 | 二磷酸磷酸酶 | 催化 | 敲除突变，减少FPP去磷酸化为法尼醇 |
| Saccharomyces cerevisiae CALI5-1 | 甲羟戊酸途径 | HMG2 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶催化域 | 催化 | 过表达截短HMGR（8拷贝rDNA整合），提高甲羟戊酸途径通量 |
| Saccharomyces cerevisiae SW24 | 倍半萜生物合成 | TEAS | 5-表-马兜铃烯合酶 | 催化 | 高产量菌株，积累约90 mg/L 5-表-马兜铃烯 |
| Saccharomyces cerevisiae SW24 | 倍半萜生物合成 | HPS | Prennaspirodiene合酶 | 催化 | 积累约90 mg/L prennaspirodiene |
| Saccharomyces cerevisiae SW24 | 倍半萜生物合成 | CVS | 瓦伦烯合酶 | 催化 | 产量较低，约10-20 mg/L valencene |
| Saccharomyces cerevisiae SW24 | 倍半萜羟基化 | EAH | 5-表-马兜铃烯-1,3-二羟化酶（细胞色素P450） | 催化 | 与P450R共表达，生成1β-羟基-epi-aristolochene和capsidiol |
| Saccharomyces cerevisiae SW24 | 倍半萜羟基化 | P450R | 烟草NADPH-细胞色素P450还原酶 | 催化 | 为P450羟化酶提供还原力，与EAH共表达时capsidiol产量超过50 mg/L |
关键发现
- WAT11菌株中TEAS基因在GAL10启动子下仅产1.2 μg/L 5-表-马兜铃烯，改用ADH1启动子后产量提高至230 μg/L
- SW24-TEAS菌株积累约90 mg/L 5-表-马兜铃烯，CAL17-1-TEAS超过70 mg/L
- SW24-HPS约90 mg/L prennaspirodiene，CAL17-1-HPS约70 mg/L
- SW24-CVS在YEp载体下最高约10 mg/L valencene，pESC载体下约20 mg/L
- 未转化SW24菌株积累超过80 mg/L法尼醇（FOH）
- 共表达EAH和P450R时，capsidiol积累超过50 mg/L，同时烃积累约40-50 mg/L，1β-羟基-epi-aristolochene也有积累
- ERG9敲除和sue突变对FPP池提升显著。
研究结论
工程化酵母可以作为高效生产倍半萜的平台，通过优化FPP前体供给和基因表达策略，能够生产高价值的倍半萜烃及其羟基化衍生物，并为研究合酶与羟化酶之间的催化偶联机制以及工业应用提供了可行平台。