Replicon-Free and Markerless Methods for Genomic Insertion of DNAs in Phage Attachment Sites and Controlled Expression of Chromosomal Genes in Escherichia coli
- 作者
- Chung-Jen Chiang, Po Ting Chen, Yun-Peng Chao
- 单位
- Department of Medical Laboratory Science and Biotechnology, China Medical University, Taichung, Taiwan, ROC; Biotechnology Experimental Center, Academia Sinica, Tainan, Taiwan, ROC; Department of Chemical Engineering, Feng Chia University, Taichung, Taiwan 40724, ROC
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2008）
- DOI
- 10.1002/bit.21976
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
质粒用于代谢工程改造存在质粒不稳定、抗生素抗性标记扩散及安全风险，需开发无复制子、无标记的染色体基因插入和可控表达方法。
研究策略
基于条件复制整合载体（CRIM）和FRT位点，将外源基因或内源基因通过噬菌体attP/attB位点特异性整合到大肠杆菌染色体，利用FLP重组酶去除复制子和筛选标记；同时构建含T7启动子-筛选标记DNA盒的模板载体，通过λ-Red重组替换染色体基因的天然启动子，实现可控表达。
研究路线图
核心内容
该研究针对质粒用于代谢工程改造时存在的不稳定、抗生素标记扩散及安全风险，开发了一套无复制子、无标记的染色体基因插入和可控表达方法。研究者基于条件复制整合载体和FRT位点，将外源番茄红素合成基因簇以及内源dxs基因通过噬菌体attP/attB位点特异性整合到大肠杆菌染色体，再利用FLP重组酶去除复制子和筛选标记；同时构建了含T7启动子-筛选标记DNA盒的模板载体，通过λ-Red重组替换染色体基因的天然启动子以实现可控表达。结果显示，获得的工程菌株BL21-CrtD1K在20 μM IPTG诱导下发酵36小时，番茄红素产量达100 mg/L，较对照提高20倍，Dxs酶活提高8倍，Pck酶活提高6倍，整合效率超过90%，且连续传代5次后产量稳定。该方法成功构建了完全不含复制子和选择标记的遗传稳定菌株，为其他代谢物和药用蛋白的清洁生产提供了通用技术平台。
创新点
首次报道完全不含复制子和选择标记的番茄红素高产大肠杆菌菌株；构建了一系列带FRT位点的整合载体和启动子替换模板载体；利用T7 RNA聚合酶统一调控多个染色体基因，实现类似regulon的诱导表达。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类异戊二烯/番茄红素合成途径 | gps | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 (GGPP synthase) | 催化 | 来自Archaeoglobus fulgidus，与crtI、crtB组成crt基因簇插入染色体 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类异戊二烯/番茄红素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，参与番茄红素合成 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类异戊二烯/番茄红素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，参与番茄红素合成 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | MEP途径（1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸途径） | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 (Dxs) | 催化 | 内源基因，可通过额外插入拷贝或原位启动子替换增强表达 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 回补代谢（TCA循环/糖异生） | pckA | 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (Pck) | 催化 | 用T7启动子替换天然启动子以增强表达 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 基因表达调控 | T7 RNA polymerase (DE3溶原) | T7 RNA聚合酶 | 调控 | 受IPTG诱导，统一调控T7启动子控制的多个目标基因 |
关键发现
- 开发了无复制子无标记的基因组插入和可控表达方法。将外源gps、crtI、crtB基因簇及内源dxs基因插入大肠杆菌基因组，经FLP重组酶去除复制子和标记后，菌株BL21-Crt、BL21-CrtD1、BL21-CrtD2、BL21-CrtD1K在20 μM IPTG诱导下发酵36 h番茄红素产量分别为5、55、10、100 mg/L（相对提高1、11、2、20倍）
- Dxs酶活分别为0.4、3.2、1.0、3.2 U/mg（相对提高1、8、2.5、8倍）
- BL21-CrtD1K的Pck酶活为0.6 U/mg（相对提高6倍）。整合效率>90%（PCR验证随机挑取菌落），工程菌株经5次连续传代后仍保持稳定产量。
研究结论
成功构建了不含复制子和选择标记的番茄红素超产大肠杆菌菌株，产量达100 mg/L且遗传稳定，该方法可推广用于其他代谢物和药用蛋白的清洁生产。