Characterization of Cyanobacterial β-Carotene Ketolase and Hydroxylase Genes in Escherichia coli, and Their Application for Astaxanthin Biosynthesis
- 作者
- Mark A. Scaife, Adam M. Burja, Phillip C. Wright
- 单位
- Biological and Environmental Systems Group, ChELSI, Department of Chemical and Process Engineering, University of Sheffield; Metabolic Engineering and Fermentation Group, Ocean Nutrition Canada Ltd
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2009）
- DOI
- 10.1002/bit.22330
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从β-胡萝卜素合成虾青素的关键步骤中，β-胡萝卜素酮化酶和羟化酶的催化效率低、基因选择不明确，导致微生物法生产虾青素产量低，难以满足商业需求。本文旨在系统表征蓝藻来源的酮化酶和羟化酶基因，并通过优化组合提高大肠杆菌中虾青素的产量。
研究策略
从5种蓝藻基因组中通过生物信息学筛选获得12个β-胡萝卜素酮化酶基因（6个CrtO型、6个CrtW型）和4个CrtR型β-胡萝卜素羟化酶基因，在大肠杆菌中异源表达，结合β-胡萝卜素和玉米黄素积累菌株进行体内功能比较，筛选最优基因，并通过新型PCR介导克隆方法构建双表达载体（pTrc/pBAD）实现虾青素的高效合成。
核心内容
该研究从五种蓝藻基因组中筛选出12个β-胡萝卜素酮化酶基因（6个CrtO型、6个CrtW型）和4个CrtR型羟化酶基因，并在大肠杆菌中进行异源表达和体内功能系统比较。在β-胡萝卜素积累菌株中，共表达单拷贝酮化酶与羟化酶可将总类胡萝卜素产量提升至1.99 mg/g（2,885 μg/L），较亲本提高23.5倍（μg/g基础），其中虾青素占91.2%。在玉米黄素积累菌株中，Gloeobacter violaceus来源的CrtW催化生成1,234.5 μg/g虾青素，且虾青素占比达92%。羟化酶比较显示Erwinia herbicola来源的CrtZ活性显著高于蓝藻CrtR（高出4.0至15.6倍）。进一步利用新型PCR介导克隆方法构建pTrc/pBAD双表达载体，以Nostoc sp. PCC 7120 CrtW与CrtZ组合获得最佳虾青素产量1,993 μg/g，占总类胡萝卜素91.2%。结果表明CrtW型酮化酶在虾青素合成中整体优于CrtO型，并提示虾青素合成可能优先经β-胡萝卜素羟化生成玉米黄素后再酮化，为微生物法生产虾青素提供了高效的基因元件与表达策略。
创新点
['首次对多个蓝藻来源的CrtO和CrtW型酮化酶及CrtR羟化酶进行系统性体内功能比较，首次功能表征了多个新基因。', '开发了一种新的PCR介导克隆方法，可快速将目标基因克隆到预定表达载体，并用于构建双表达载体。', '通过组合最优CrtW酮化酶和CrtZ羟化酶，实现了虾青素产量的大幅提高和纯度优化。']
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→角黄素） | crtO (ZP_00111616) | CrtO β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Nostoc punctiforme PCC 73102，首次功能表征 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→角黄素） | crtO (ZP_00112486) | CrtO β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Nostoc punctiforme PCC 73102，首次功能表征 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→角黄素） | crtO (YP_322099) | CrtO β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Anabaena variabilis ATCC 29413，首次功能表征 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→角黄素） | crtO (NP_487784) | CrtO β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Nostoc sp. PCC 7120，首次异源功能表征 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→角黄素） | crtO (NP_923340) | CrtO β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Gloeobacter violaceus PCC 7421 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→角黄素） | crtO (NP_442491) | CrtO β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Synechocystis sp. PCC 6803，CrtO类中活性最高，能催化单酮和双酮产物 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→角黄素） | crtW (ZP_00345866.1) | CrtW β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Nostoc punctiforme PCC 73102，产生最高角黄素产量1,113.8 μg/g |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→角黄素） | crtW (YP_322565.1) | CrtW β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Anabaena variabilis ATCC 29413，首次功能表征 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→角黄素） | crtW (YP_324388.1) | CrtW β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Anabaena variabilis ATCC 29413，虾青素合成高效，双表达载体中产量687 μg/g |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→角黄素） | crtW (NP_487229.1) | CrtW β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Nostoc sp. PCC 7120，双表达载体中虾青素产量最高1,993 μg/g |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→角黄素） | crtW (ZP_00111258.2) | CrtW β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Nostoc punctiforme PCC 73102 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→角黄素） | crtW (NP_924674.1) | CrtW β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 来自Gloeobacter violaceus PCC 7421，在玉米黄素积累菌株中虾青素产量最高1,234.5 μg/g |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→玉米黄素） | crtR (ZP_00106832.1) | CrtR β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自Nostoc punctiforme PCC 73102，无功能 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→玉米黄素） | crtR (YP_322210.1) | CrtR β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自Anabaena variabilis ATCC 29413，首次功能表征，产生18 μg/g玉米黄素 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→玉米黄素） | crtR (NP_488049.1) | CrtR β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自Nostoc sp. PCC 7120，无功能 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→玉米黄素） | crtR (NP_440788.1) | CrtR β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自Synechocystis sp. PCC 6803，产生69 μg/g玉米黄素，CrtR类中活性最高 |
| Escherichia coli TOP10 | 类胡萝卜素生物合成（β-胡萝卜素→玉米黄素） | crtZ (M87280) | CrtZ β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，产生279 μg/g玉米黄素，活性显著高于蓝藻CrtR，用于双表达载体 |
关键发现
- 在β-胡萝卜素积累的大肠杆菌中，共表达单个β-胡萝卜素酮化酶和羟化酶基因，总类胡萝卜素产量达1.99 mg/g（2,885 μg/L），比亲本菌株提高23.5倍（μg/g基础）或17.6倍（μg/L基础），其中虾青素占91.2%。具体而言，CrtW酮化酶中，Nostoc punctiforme PCC 73102（ZP_00345866.1）催化生成1,113.8 μg/g（1,430 μg/L）角黄素
- Anabaena variabilis ATCC 29413（YP_324388.1）生成578.8 μg/g（783.2 μg/L）
- Nostoc sp. PCC 7120（NP_487229.1）生成621.6 μg/g（804 μg/L）。在玉米黄素积累的大肠杆菌中，Gloeobacter violaceus PCC 7421（NP_924674.1）和Nostoc sp. PCC 7120（NP_487229.1）的CrtW分别催化合成1,234.5 μg/g（1,407.2 μg/L）和1,082.8 μg/g（1,559.8 μg/L）虾青素，Anabaena variabilis（YP_324388.1）产生922.7 μg/g（1,190.5 μg/L），且虾青素占总类胡萝卜素的92%。羟化酶比较中，Synechocystis sp. PCC 6803 CrtR产生69 μg/g玉米黄素，A. variabilis CrtR产生18 μg/g，而Erwinia herbicola CrtZ产生279 μg/g，活性分别高出4.0和15.6倍。双表达载体pTrcCrtW-pBADCrtZ（Nostoc sp. PCC 7120 CrtW）产虾青素1,993 μg/g（2,885 μg/L），占91.2%
- pTrcCrtW-pBADCrtZ（N. punctiforme CrtW）产虾青素1,931 μg/g（3,385 μg/L），占87.4%
- A. variabilis CrtW组合产687 μg/g（1,492 μg/L），占83.8%。
研究结论
通过系统表征蓝藻来源的β-胡萝卜素酮化酶和羟化酶，证实CrtW型酮化酶在虾青素合成中普遍优于CrtO型，且合适的基因表达组合（pTrcCrtW-pBADCrtZ）能显著提高虾青素产量和纯度。实验结果提示虾青素合成可能优先经过β-胡萝卜素羟化生成玉米黄素，再经酮化生成虾青素。该研究为微生物法生产虾青素提供了高效的基因元件和表达策略。