Characterization of a Whole-Cell Catalyst Co-Expressing Glycerol Dehydrogenase and Glucose Dehydrogenase and Its Application in the Synthesis of L-Glyceraldehyde
- 作者
- Nina Richter, Markus Neumann, Andreas Liese, Roland Wohlgemuth, Andrea Weckbecker, Thorsten Eggert, Werner Hummel
- 单位
- Evocatal GmbH, Merowingerplatz 1a, 40225 Düsseldorf, Germany; Institut für Technische Biokatalyse, Technische Universität Hamburg-Harburg, Hamburg, Germany; Research Specialties, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Buchs, Switzerland; Institut für Molekulare Enzymtechnologie, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, Forschungszentrum Jülich, Stettemischer Forst, Jülich, Germany
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2010）
- DOI
- 10.1002/bit.22714
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解决甘油脱氢酶合成L-甘油醛过程中辅酶NADP+昂贵且需要外加、游离酶稳定性差及难以回收的问题，构建共表达脱氢酶的全细胞催化剂以实现辅酶原位再生和催化剂循环使用。
研究策略
在大肠杆菌BL21(DE3)中利用pETDuet-1载体共表达来自氧化葡萄糖酸杆菌的甘油脱氢酶（GlyDH）和来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶（GDH），构建全细胞催化剂；以葡萄糖为辅助底物由GDH再生NADPH，GlyDH催化甘油醛不对称还原；并系统表征培养条件、温度、pH、辅酶添加、透化处理及循环使用性能。
研究路线图
核心内容
本研究在大肠杆菌BL21(DE3)中利用pETDuet-1载体共表达氧化葡萄糖酸杆菌的甘油脱氢酶（GlyDH）和枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶（GDH），构建了无需外加昂贵辅酶的全细胞催化剂。该系统以葡萄糖为辅助底物，由GDH原位再生NADPH，GlyDH催化甘油醛的不对称还原，实现了外消旋甘油醛的动力学拆分。系统表征显示，该全细胞催化剂在4°C缓冲液中保存48小时活性完全保留，而游离酶系统残余活性仅18.9%；催化剂可重复使用至少5个循环而无活性损失，第4、5循环反应时间缩短至15分钟。在4克规模的制备反应中，获得54%转化率和98%对映体过量（ee）的L-甘油醛。此外，甲苯透化处理可将初始速率提高1.3倍。与游离酶系统相比，该全细胞催化剂在稳定性、可回收性和经济性方面均具优势，为工业和制备规模生产对映纯L-甘油醛提供了高效且低成本的催化方案。
创新点
构建了共表达GlyDH/GDH的单质粒全细胞催化剂，实现辅酶原位再生；催化剂在缓冲液中48小时完全稳定，且可循环使用至少5次而无活性损失；无需外加辅酶（或仅需少量NADP+）即可在制备规模实现外消旋甘油醛的动力学拆分，获得高对映选择性的L-甘油醛。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甘油醛还原（L-甘油醛合成） | glydh | 甘油脱氢酶 (GlyDH) | 催化 | 来自Gluconobacter oxydans，NADP+依赖，催化甘油醛不对称还原 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 辅酶NADPH再生（葡萄糖氧化） | gdh | 葡萄糖脱氢酶 (GDH) | 催化 | 来自Bacillus subtilis，氧化D-葡萄糖再生NADPH，实现辅酶循环 |
关键发现
- 全细胞催化剂还原己醛的活性为27.2±7.3 U/g；添加1 mM NADP+使反应速率提高4.6倍，5 mM时仅提高2.9倍；甲苯透化处理提高初始速率1.3倍；最适温度40°C（较30°C提高1.6倍），60°C时残余活性20%；pH
- 0时活性最高为132.1%，pH
- 5时活性损失约70%；在缓冲液中保存48h全细胞催化剂活性完全保留，而游离酶系统残余活性仅18.9%；在催化反应条件下48h后全细胞催化剂残余活性16.7%，游离酶系统残余活性26.8%；重复批次转化己醛5个循环无活性损失，第4、5循环反应时间缩短至15分钟；动力学拆分外消旋甘油醛（4 g规模）获得54%转化率和98% ee的L-甘油醛；底物谱比较：全细胞催化剂对丁醛、己醛、rac-甘油醛、苯甲醛的相对活性分别为17.9%、100%、78.8%、72.2%，而纯酶对应为73.0%、100%、122.6%、43.3%。
研究结论
所构建的共表达GlyDH和GDH的全细胞催化剂在稳定性、可回收性和经济性上优于游离酶系统，无需外加昂贵辅酶即可实现L-甘油醛的直接酶法一步合成，为工业和制备规模生产对映纯L-甘油醛提供了高效催化剂。