Metabolic Engineering of Monoterpene Synthesis in Yeast
- 作者
- Marc J. C. Fischer, Sophie Meyer, Patricia Claudel, Marc Bergdoll, Francis Karst
- 单位
- Univ Strasbourg, INRA, Inst Natl Recherche Agron, Métab Second Vigne, Unit Mixte Recherche Santé Vigne & Qual Vins, 28 rue de Herrlisheim, F-68021 Colmar, France; The Inst Biol Mol Plantes, Univ Strasbourg, CNRS, F-67084 Strasbourg Cedex, France
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2011）
- DOI
- 10.1002/bit.23129
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
酿酒酵母缺乏特异性 GPP 合酶，FPPS 将 GPP 迅速转化为 FPP，导致单萜合成前体 GPP 不足，异源表达单萜合酶产量低。
研究策略
对酿酒酵母 FPPS 基因 ERG20 催化位点 K197 进行饱和诱变，获得能够释放 GPP 的突变体，并结合罗勒香叶醇合酶（GES）异源表达，评估单萜醇产量与菌株生长、甾醇代谢的关系。
核心内容
该研究针对酿酒酵母单萜合成前体香叶基焦磷酸（GPP）供应不足的问题，对法尼基焦磷酸合酶基因ERG20的催化位点K197进行了饱和诱变，获得18种氨基酸替换菌株，并结合罗勒香叶醇合酶（GES）异源表达，系统评估了突变对菌株生长、甾醇代谢及单萜醇产量的影响。结果显示，K197M和K197Q可能致死而无法获得；多数突变株倍增时间延长至4.14–17.61小时，甾醇含量变动于0.37%–0.59%干重。未表达GES时，K197A单萜醇总产量最高约656 μg/L；表达GES后，K197G、A、S、T、D、E、C、L等突变体单萜醇产量大幅提升，其中K197G产量最高达5,557 μg/L（香叶醇5,366 μg/L），显著优于此前报道的大肠杆菌约10 μg/L、野生型酵母约500 μg/L及已知K197E突变约1 mg/L的水平。稳定性实验表明香叶醇在酸性条件下部分转化为芳樟醇，香茅醇则可能来自酶促还原。该研究提供了一系列生长代价小且GPP释放能力增强的酵母底盘，为工业单萜生产提供了多样化选择。
创新点
系统评估了 FPPS K197 位点 18 种氨基酸替换对酵母生长、甾醇含量及单萜醇合成的影响；发现多个突变体（如 K197G、A、S、T）可大幅提高 GPP 可利用性，结合 GES 表达使香叶醇产量达 5 mg/L 以上，显著优于已知的 K197E 突变。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶（FPPS） | 催化 | 催化 IPP 与 DMAPP 缩合生成 GPP，再与 IPP 缩合生成 FPP；K197 点突变影响 GPP 释放 |
| Saccharomyces cerevisiae | 单萜生物合成（异源） | Ocimum basilicum GES | 香叶醇合酶（GES） | 催化 | 异源表达，将 GPP 转化为香叶醇，与 GFP 融合表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 麦角甾醇合成 | ERG20 | FPPS | 催化 | 通过控制 FPP 供给影响麦角甾醇合成，突变体甾醇含量变化与生长相关 |
关键发现
- 对酿酒酵母 ERG20 基因 K197 位点进行饱和突变，获得 18 种氨基酸替换菌株，K197M 和 K197Q 无法获得（可能致死）。未表达 GES 时，多数突变株倍增时间增加（4.14 h–17.61 h），K197H 无显著变化；甾醇含量变动于
- 37%–0.59% 干重之间。未表达 GES 时，单萜醇总产量最高为 K197A 约 656 μg/L（香叶醇 284 μg/L、芳樟醇 360 μg/L）。异源表达罗勒 GES 后，K197G、A、S、T、D、E、C、L 等菌株单萜醇产量大幅提升，最高达 5,557 μg/L（约
- 6 mg/L，K197G：香叶醇 5,366 μg/L、芳樟醇 123 μg/L、香茅醇 68 μg/L），而 K197I、P、F、Y、W、K、H、N 产量低于 105 μg/L。产量显著优于此前报道：大肠杆菌约 10 μg/L、未修饰 ERG20 的酵母约 500 μg/L、K197E 突变约 1 mg/L。香叶醇稳定性实验显示，pH
- 4 下 65 天后
- 5% 香叶醇残留，20.6% 转化为芳樟醇；pH
- 0 下
- 9% 残留，14.6% 转化为橙花醇；香茅醇不来自化学转化，而可能是酶促还原产物。
研究结论
通过 FPPS K197 饱和突变，可获得一系列 GPP 释放能力增强的酵母菌株；其中 K197G、C、S、T、D、E 在表达 GES 后单萜醇产量高且生长代价小，适合作为异源单萜合酶表达平台，为工业酵母单萜生产提供了多种底盘选择。