Novel Iron-Sulfur Containing NADPH-Reductase From Nocardia farcinica IFM10152 and Fusion Construction With CYP51 Lanosterol Demethylase
- 作者
- Kwon-Young Choi, Eun-Ok Jung, Da-Hye Jung, Bishnu Prasad Pandey, Nahum Lee, Hyungdon Yun, Hyung-yun Park, Byung-Gee Kim
- 单位
- School of Chemical and Biological Engineering, Institute of Bioengineering, Seoul National University, Seoul, South Korea; School of Biotechnology, Yeungnam University, Gyeongsan, Gyeongbuk, South Korea; Korea Bio-Hub Center, Bio-MAX Institute, Seoul National University, Seoul, South Korea
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2012）
- DOI
- 10.1002/bit.24359
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
CYP51（羊毛脂醇14α-脱甲基酶）依赖外部电子传递系统，天然催化效率低，限制了其应用。
研究策略
从Nocardia farcinica IFM10152中鉴定出与CYP51基因成簇的含铁硫簇NADPH-还原酶FprD，通过柔性linker将CYP51与FprD融合，构建自给自足的人工P450融合酶。
研究路线图
核心内容
该研究从Nocardia farcinica IFM10152中鉴定出一种与CYP51基因成簇的含铁硫簇NADPH-还原酶FprD，并利用柔性linker将其与羊毛脂醇14α-脱甲基酶CYP51融合，构建了两种自给自足的人工P450单加氧酶融合体（F1和F2）。在E. coli BL21(DE3)中异源表达后，融合酶催化效率显著提升：F1和F2的kcat/Km分别达96.91和105.79 nmol/min/nmol，较单独的CYP51/FprD重构系统提高约35倍，kcat分别达1002.05和1317.11 nmol/min/nmol，约为重构系统的30倍，Km分别为10.34 μM和12.45 μM。融合酶对NADPH的偏好性远高于NADH，其还原活性约为600 μmol cyt c/min/μmol CYP，而NADH仅贡献约10。结构分析显示FprD的4Fe-4S簇与FAD距离为11.10 Å，表明融合可实现高效分子内电子传递，同时检测到单羟基化副产物（m/z 587）。该工作首次将I型细菌CYP51与含铁硫簇还原酶融合，为构建高效自给自足的P450催化系统提供了新的设计策略。
创新点
首次报道将类I型细菌CYP51与含铁硫簇的NADPH-还原酶融合，形成新型自给自足P450单加氧酶；利用FdxG类似序列作为电子传递模块。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | — | — | — | 用于表达CYP51、FprD及融合蛋白的宿主菌 |
| — | 羊毛脂醇14α-脱甲基代谢（甾醇生物合成） | CYP51 | CYP51（羊毛脂醇14α-脱甲基酶） | 催化 | 来自Nocardia farcinica IFM10152，催化羊毛脂醇14α-甲基氧化去除 |
| — | — | FprD | FprD（含铁硫簇NADPH-还原酶） | 能量供给 | 来自Nocardia farcinica IFM10152，含4Fe-4S簇和FAD结合域，传递电子给CYP51 |
| — | — | CYP51-FprD F1 | CYP51-FprD融合蛋白F1 | 催化 | 连接肽STEQSAKEAPAETLGAFR |
| — | — | CYP51-FprD F2 | CYP51-FprD融合蛋白F2 | 催化 | 连接肽AAVDAKASAGEAPAETLGAFR |
关键发现
- 融合酶CYP51-FprD F1和F2的kcat/Km分别为96.91和105.79 nmol/min/nmol，比单独的CYP51/FprD重构系统高约35倍
- kcat分别达到1002.05和1317.11 nmol/min/nmol，比重构系统（40.17 nmol/min/nmol）高约30倍
- Km分别为10.34 μM和12.45 μM
- 融合酶偏好NADPH（约600 μmol cyt c/min/μmol CYP）而非NADH（约10）
- FprD的4Fe-4S簇与FAD距离为11.10 Å
- 此外还检测到单羟基化副产物（m/z 587）。
研究结论
将含铁硫簇的NADPH还原酶FprD与CYP51融合可实现高效分子内电子传递，显著提高羊毛脂醇14α-脱甲基活性，为构建自给自足P450系统提供了新策略。