Production of Militradiene by Metabolically Engineered Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Zhubo Dai, Yi Liu, Luqi Huang, Xueli Zhang
- 单位
- Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences; College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology; Institute of Chinese Materia Medica, Chinese Academy of Chinese Medical Science
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2012）
- DOI
- 10.1002/bit.24547
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中构建高效合成丹参酮关键前体militradiene的代谢途径，解决天然提取产量低、化学合成困难的问题。
研究策略
将丹参来源的SmCPS和SmKSL基因整合到酵母染色体，通过模块化过表达tHMGR和upc2.1增强FPP供应，过表达ERG20-BTS1融合蛋白和SaGGPS增强GGPP供应，并用抗生素标记替代营养缺陷标记以利用丰富培养基，最后进行补料分批发酵。
研究路线图
核心内容
本研究通过在酿酒酵母BY4742中构建丹参酮关键前体militradiene的异源合成途径，旨在替代天然提取和化学合成路线。研究将丹参来源的SmCPS和SmKSL基因整合至酵母染色体，并系统优化萜类前体供应：模块化过表达tHMGR和upc2.1以增强FPP供应，通过ERG20-BTS1融合蛋白与SaGGPS协同提升GGPP供应，同时以抗生素标记替换营养缺陷标记以实现在丰富培养基中高密度培养。结果显示，初始整合菌株仅产4.2 mg/L militradiene；单独过表达tHMGR和upc2.1未提高目标产物产量，反而积累大量角鲨烯；过表达ERG20-BTS1-SaGGPS使产量提升至8.8 mg/L。更换抗生素标记并组合过表达上述模块后，最高产量达61.8 mg/L，比初始菌株提高11.4倍。最终在补料分批发酵中，工程菌ZD-T-026产量达488 mg/L，细胞干重含量11.3 mg/g。该工作首次实现SmCPS/SmKSL在酵母染色体上的整合，通过前体供应协同优化大幅提升了二萜产量，为丹参酮类化合物的微生物规模化生产奠定了重要基础。
创新点
首次将SmCPS和SmKSL整合至酵母染色体生产militradiene；利用ERG20-BTS1融合和SaGGPS协同提高GGPP供应；抗生素标记替换实现丰富培养基培养；组合过表达策略协同提升产量至61.8 mg/L。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 二萜生物合成途径（丹参酮前体） | SmCPS | 柯巴基二磷酸合酶 | 催化 | 来自丹参，催化GGPP生成CPP，整合至酵母染色体δ位点。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 二萜生物合成途径（丹参酮前体） | SmKSL | normal CPP kaurene synthase-like | 催化 | 来自丹参，催化CPP生成militradiene，整合至酵母染色体δ位点。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径 | tHMGR | 截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 截短形式增强催化活性，提高FPP前体供应。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径（全局调控） | upc2.1 | 甾醇摄取控制蛋白2（突变体） | 调控 | 半显性突变等位基因，增强甲羟戊酸途径相关基因表达。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径/萜类前体合成 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化IPP和DMAPP生成FPP，与BTS1融合表达以加速FPP流向。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径/萜类前体合成 | BTS1 | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化FPP生成GGPP，与ERG20融合表达以提高GGPP供应。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 萜类前体合成 | SaGGPS | 香叶基香叶基焦磷酸合酶（来自硫磺矿硫化叶菌） | 催化 | 异源表达，可催化IPP和DMAPP直接合成GGPP，避免与角鲨烯合酶竞争FPP。 |
关键发现
- 初始整合菌株ZD-T-010在SD培养基中产生4.2 mg/L militradiene（含量4.4 mg/g细胞干重）
- 过表达tHMGR和upc2.1未提高产量，但积累大量角鲨烯（71和78 mg/L）
- 过表达ERG20-BTS1-SaGGPS使产量提高57%（6.6 mg/L）和110%（8.8 mg/L）
- 使用YPD培养基后细胞质量从0.94 g/L增至7.4 g/L，产量从4.5 mg/L增至5.6 mg/L
- 更换抗生素标记后，单独过表达ERG20-BTS1-SaGGPS产量达28.2 mg/L（低拷贝）和25.7 mg/L（高拷贝），比亲本提高5.2倍和4.8倍
- 组合过表达tHMGR-upc2.1和ERG20-BTS1-SaGGPS，最高产量达61.8 mg/L（ZD-T-026），比初始菌株提高11.4倍
- 补料分批发酵中ZD-T-026产量达488 mg/L，含量11.3 mg/g细胞干重，细胞质量43 g/L。
研究结论
通过整合SmCPS/SmKSL并优化前体供应，成功在酿酒酵母中实现militradiene的高效生产，补料分批发酵产量达488 mg/L，为丹参酮的微生物生产奠定了基础。