Cloning and Characterization of a Panel of Constitutive Promoters for Applications in Pathway Engineering in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Jie Sun, Zengyi Shao, Hua Zhao, Nikhil Nair, Fei Wen, Jian-He Xu, Huimin Zhao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign; State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology; Departments of Chemistry, Biochemistry, and Bioengineering, Institute for Genomic Biology, Center for Biophysics and Computational Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2012）
- DOI
- 10.1002/bit.24481
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
酿酒酵母中已知组成型启动子数量有限，且缺乏在不同培养条件下并行表征的数据，限制了大型生化途径的构建与优化。
研究策略
克隆了14个酿酒酵母组成型启动子，以GFP为报告基因在2μ载体pRS426中，于不同葡萄糖和氧气浓度条件下表征其强度；并将中高强度启动子应用于木聚糖降解和玉米黄素生物合成途径的组装，构建整合生物加工菌株。
研究路线图
核心内容
本研究系统克隆并表征了酿酒酵母中14个组成型启动子，以GFP作为报告基因，在2μ载体pRS426中分别考察了不同葡萄糖浓度和氧气条件下的启动子强度。结果显示，这些启动子的GFP平均荧光强度差异不超过6倍，其中TEF1p活性最强，PGI1p最弱；在氧充足且葡萄糖丰富条件下，PGI1p和ADH1p的强度分别仅为TEF1p的23%和26%，而在氧限制且葡萄糖丰富条件下分别升至32%和36%，葡萄糖限制条件下TEF1p比PGI1p强5至6倍，表明启动子行为受培养条件显著影响。基于表征结果，作者选取中高强度启动子，利用DNA组装器构建了包含木聚糖降解、D-木糖利用和玉米黄素生物合成基因的十基因人工途径，整合至酿酒酵母L2612中，成功实现了从2%桦木木聚糖直接发酵生产玉米黄素，产量为0.74±0.02 mg/L。该研究为多基因途径的精细调控提供了可参考的启动子工具箱，并展示了其在整合生物加工中直接利用廉价底物合成高价值产物的应用潜力。
创新点
系统克隆并比较了14个组成型启动子在多种常规培养条件下的强度；利用表征的启动子通过DNA组装器构建了十基因人工途径，实现从桦木木聚糖直接生产玉米黄素。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae YSG50 | 启动子表征 | — | — | 调控 | 用于克隆和表征14个组成型启动子，以GFP为报告基因 |
| Saccharomyces cerevisiae L2612 | 木聚糖降解 | Xyn2 | 内切-1,4-β-木聚糖酶 | 催化 | 来自Trichoderma reesei，受TEF2p控制并分泌表达 |
| Saccharomyces cerevisiae L2612 | 木聚糖降解 | XlnD | β-木糖苷酶D | 催化 | 来自Aspergillus niger，受TEF1p控制并分泌表达 |
| Saccharomyces cerevisiae L2612 | 玉米黄素生物合成 | CrtE | GGPP合酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，受PDC1p控制 |
| Saccharomyces cerevisiae L2612 | 玉米黄素生物合成 | CrtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，受TPI1p控制 |
| Saccharomyces cerevisiae L2612 | 玉米黄素生物合成 | CrtI | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，受GPM1p控制 |
| Saccharomyces cerevisiae L2612 | 玉米黄素生物合成 | CrtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，受GPDp控制 |
| Saccharomyces cerevisiae L2612 | 玉米黄素生物合成 | CrtZ | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，受FBA1p控制 |
| Saccharomyces cerevisiae L2612 | D-木糖利用 | XR | 木糖还原酶 | 催化 | 来自Scheffersomyces stipitis，受ADH1p控制并整合至基因组 |
| Saccharomyces cerevisiae L2612 | D-木糖利用 | XDH | 木糖醇脱氢酶 | 催化 | 来自Scheffersomyces stipitis，受PGK1p控制并整合至基因组 |
| Saccharomyces cerevisiae L2612 | D-木糖利用 | XKS | D-木酮糖激酶 | 催化 | 来自Scheffersomyces stipitis，受PYK1p控制并整合至基因组 |
| Saccharomyces cerevisiae | 启动子表征 | TEF1p | — | 调控 | 强度最高的组成型启动子，用于XlnD表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 启动子表征 | TEF2p | — | 调控 | 强启动子，用于Xyn2表达 |
| Saccharomyces cerevisiae | 启动子表征 | PGI1p | — | 调控 | 强度最弱的启动子之一，用于对比 |
关键发现
- 14个启动子的GFP平均荧光强度差异不超过6倍，其中TEF1p最强，PGI1p最弱
- 在氧充足且葡萄糖丰富条件下，PGI1p和ADH1p强度分别为TEF1p的23%和26%，在氧限制且葡萄糖丰富条件下分别为32%和36%
- 在葡萄糖限制条件下，TEF1p比PGI1p强5-6倍
- 工程菌株从2%桦木木聚糖直接生产玉米黄素，产量为0.74±0.02 mg/L。
研究结论
本研究成功表征了14个组成型启动子，为多基因途径的精细调控提供了工具箱，并通过构建能直接利用木聚糖生产玉米黄素的酿酒酵母菌株，展示了这些启动子在整合生物加工中的应用潜力。