Whole-Cell-Based CYP153A6-Catalyzed (S)-Limonene Hydroxylation Efficiency Depends on Host Background and Profits From Monoterpene Uptake via AlkL
- 作者
- Sjef Cornelissen, Mattijs K. Julsing, Jan Volmer, Ole Riechert, Andreas Schmid, Bruno Buhler
- 单位
- Department of Biochemical and Chemical Engineering, Laboratory of Chemical Biotechnology, TU Dortmund University, Emil-Figge-Strasse 66, 44227 Dortmund, Germany
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2013）
- DOI
- 10.1002/bit.24801
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
CYP153A6催化(S)-柠檬烯羟化制备(S)-紫苏醇过程中存在底物传质限制和副产物（紫苏醛、紫苏酸）形成问题，导致产率和选择性下降。
研究策略
比较不同宿主（P. putida KT2440 与 E. coli W3110）的副产物形成差异，通过更换宿主为E. coli W3110消除紫苏酸形成，并共表达外膜蛋白AlkL增强底物摄取，提高羟化活性。
研究路线图
核心内容
本研究针对CYP153A6催化(S)-柠檬烯羟化制备(S)-紫苏醇过程中底物传质受限及副产物积累的问题，系统比较了恶臭假单胞菌KT2440与大肠杆菌W3110作为全细胞催化宿主的性能差异。研究发现，P. putida KT2440两相体系中副产物紫苏醛和紫苏酸占总氧化萜烯的26%，而E. coli W3110因缺乏将紫苏醛氧化为紫苏酸的酶系，且具备将紫苏醛还原为紫苏醇的内源脱氢酶活性（速率4.9 U/gCDW），可完全避免紫苏酸形成。进一步在E. coli W3110中共表达外膜蛋白AlkL以增强疏水底物摄取，羟化活性由7.1 U/gCDW提升至16.6 U/gCDW，单相体系提高2.1倍、两相体系提高5倍。在最优两相生物转化中，E. coli W3110（pCom8-PFR1500L）于26小时内积累39.2 mmol/L（5.96 g/L）紫苏醇，无紫苏酸生成，紫苏醛仅占8%，产率达0.23 g/L/h，显著优于P. putida体系的0.18 g/L/h。结果表明，宿主背景对CYP153A6催化效率具有决定性影响，共表达AlkL是增强疏水底物全细胞生物转化的有效通用策略。
创新点
首次证明E. coli W3110作为CYP153A6宿主可避免紫苏酸副产物，且紫苏醛被还原为紫苏醇；发现AlkL共表达可提高E. coli的柠檬烯羟化活性（单相2倍、两相5倍），实现高效两相生物转化。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida KT2440 | (S)-柠檬烯羟化生成(S)-紫苏醇 | CYP153A6 | CYP153A6 | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶，来源于Mycobacterium sp. HXN-1500，催化柠檬烯C-H键羟化 |
| Escherichia coli W3110 | (S)-柠檬烯羟化生成(S)-紫苏醇 | CYP153A6 | CYP153A6 | 催化 | 重组表达CYP153A6，实现高活性羟化 |
| Escherichia coli W3110 | 底物跨膜摄取 | alkL | AlkL | 转运 | 外膜蛋白，促进柠檬烯等疏水底物进入细胞 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 紫苏醇过度氧化副产物途径 | alkJ | AlkJ | 催化 | pGEc47ΔB编码的醇脱氢酶（候选），参与紫苏醇氧化为紫苏醛/酸 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 紫苏醛氧化为紫苏酸 | — | 宿主内源脱氢酶 | 催化 | 宿主固有的紫苏醛脱氢酶，以2.4 U/gCDW速率氧化紫苏醛 |
| Escherichia coli W3110 | 紫苏醛还原为紫苏醇 | — | 宿主内源脱氢酶 | 催化 | NAD(P)H依赖性脱氢酶，以4.9 U/gCDW还原紫苏醛，不氧化为紫苏酸 |
| Escherichia coli W3110 | 电子传递 | ferredoxin/ferredoxin reductase | 铁氧还蛋白/铁氧还蛋白还原酶 | 能量供给 | 来自Mycobacterium HXN-1500，为CYP153A6传递电子 |
| Pseudomonas putida KT2440 | 烷烃降解基因簇 | alkBFGHJKL和alkST | AlkBGT等 | 催化 | pGEc47ΔB包含除alkB外的烷烃降解基因，提高CYP153A6表达和活性 |
关键发现
- P. putida KT2440（pGEc47ΔB）（pCom8-PFR1500）两相体系中副产物紫苏醛和紫苏酸占总氧化萜烯的26%
- E. coli W3110催化紫苏醛还原为紫苏醇（速率4.9 U/gCDW），不氧化为紫苏酸
- E. coli W3110（pCom8-PFR1500）的羟化活性为7.1 U/gCDW，共表达AlkL后活性提高至16.6 U/gCDW（单相2.1倍，两相5倍）
- 两相生物转化中，E. coli W3110（pCom8-PFR1500L）在26 h内产生39.2 mmol/L（5.96 g/L）紫苏醇，无紫苏酸，紫苏醛仅占8%
- P. putida KT2440（pGEc47ΔB）（pCom8-PFR1500）则产生紫苏酸1.25 g/L，紫苏醇产率0.18 g/L/h
- E. coli（pCom8-PFR1500）和（pCom8-PFR1500L）的紫苏醇产率分别为0.09和0.23 g/L/h。
研究结论
E. coli W3110优于P. putida作为CYP153A6宿主用于(S)-紫苏醇生产，共表达alkL可显著提高生物转化效率，是一种增强疏水底物全细胞生物催化的有效策略。