Oxyfunctionalization of Aliphatic Compounds by a Recombinant Peroxygenase From Coprinopsis cinerea
- 作者
- Esteban D. Babot, José C. del Rio, Lisbeth Kalum, Angel T. Martínez, Ana Gutiérrez
- 单位
- Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla, CSIC, Seville, Spain; Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark; Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, Spain
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2013）
- DOI
- 10.1002/bit.24904
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在温和、环境友好条件下对脂肪族化合物进行选择性氧官能化，利用低成本酶催化剂替代强氧化剂，解决传统有机合成中区域选择性差的问题。
研究策略
通过基因组挖掘从Coprinopsis cinerea中获得过氧合酶基因（JGI模型CC1G_08427T0），并在工业真菌宿主Aspergillus oryzae中异源表达，以H2O2为唯一共底物催化脂肪族底物的区域选择性羟基化，同时与野生型A. aegerita过氧合酶进行对比。
研究路线图
核心内容
本研究从灰盖鬼伞（Coprinopsis cinerea）基因组中挖掘获得过氧合酶基因CC1G_08427T0，并在工业丝状真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）中实现异源分泌表达，获得分子量约44 kDa、Soret带位于418 nm、比活约100 U/mg的重组酶。以H2O2为唯一共底物，该酶对游离及酯化脂肪酸、脂肪醇和长链烷烃均表现出显著的区域选择性羟基化活性。饱和脂肪酸C12–C18均可被转化，其中肉豆蔻酸和棕榈酸在30分钟内几乎完全转化，月桂酸等底物的ω-1/ω-2羟基化比例各异；肉豆蔻烯酸专一生成ω-2羟基化产物。正十四烷在20%丙酮中30分钟转化率为52%，以二羟基及羟基-酮衍生物为主（69.6%），而在40%丙酮中转化率升至64%，单羟基产物比例提高。与已报道的A. aegerita过氧合酶相比，该重组酶性能更优，且可溶性重组表达便于蛋白质工程改造及规模化生产，为温和条件下惰性脂肪族化合物的选择性氧官能化提供了有前景的工业生物催化剂。
创新点
['首次评估重组C. cinerea过氧合酶对游离/酯化脂肪酸、脂肪醇和长链烷烃的氧化功能', '该重组酶性能优于已报道的A. aegerita过氧合酶', '能够将长链烷烃羟基化为单羟基及双羟基衍生物，反应产物分布受丙酮浓度调控', '重组性质便于酶工程改造和工业大规模生产']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus oryzae | 重组过氧合酶异源表达 | CC1G_08427T0 | C. cinerea过氧合酶 | 催化 | 来自Coprinopsis cinerea基因组的基因模型，在工业宿主中表达 |
| Coprinopsis cinerea | 过氧合酶生物合成 | CC1G_08427T0 | C. cinerea过氧合酶 | 催化 | 基因来源生物，基因组已测序 |
| Agrocybe aegerita | 过氧合酶产生 | — | A. aegerita过氧合酶（同工酶II） | 催化 | 野生型过氧合酶，用于对比研究 |
关键发现
- 重组C. cinerea过氧合酶（44 kDa，Soret带418 nm，比活约100 U/mg）对多种脂肪族化合物具有区域选择性羟基化活性。饱和脂肪酸C12-C18均可被转化，其中肉豆蔻酸和棕榈酸30 min内几乎完全转化；月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸的ω-1/ω-2羟基化比例分别为57/43、49.5/43、38.4/52.9、31.5/50.2；肉豆蔻烯酸仅生成ω-2羟基化产物（100%）；油酸ω-1与ω-2比例为33.3/66.8。脂肪酸甲酯和单甘油酯也被羟基化，但二/三甘油酯不反应；辛酸辛酯30 min转化率40%，单肉豆蔻酸甘油酯转化率47%。1-十四醇转化率72%，主要产物为肉豆蔻酸（75.8%）及少量ω-1/ω-2二醇。正十四烷在20%丙酮中30 min转化率52%，主要生成二羟基及羟基-酮衍生物（69.6%）；在40%丙酮中30 min转化率64%，单羟基衍生物为主（ω-1
- 8%，ω-2
- 7%）。trans-7-十四烯转化率81%，而cis-1-十四烯几乎不反应。
研究结论
重组C. cinerea过氧合酶是一种有前景的工业生物催化剂，能够区域选择性地氧官能化多种脂肪族化合物，包括惰性的长链烷烃，且其重组性质有利于蛋白质工程和大规模生产。