Metabolic engineering of 3-hydroxypropionic acid biosynthesis in Escherichia coli
- 作者
- Hun Su Chu, Young Soo Kim, Chan Mu Lee, Ju Hee Lee, Won Seok Jung, Jin Ho Ahn, Seung Hoon Song, In Suk Choi, Kwang Myung Cho
- 单位
- Biomaterials Lab, Material Research Center, Samsung Advanced Institute of Technology, Samsung Electronics Co., Ltd., 130 Samsung-ro, Yeongtong-gu, Suwon-si, Gyeonggi-do, Korea
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2014）
- DOI
- 10.1002/bit.25444
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
3-羟基丙酸（3-HP）生物合成中，中间产物3-羟基丙醛（3-HPA）的毒性积累限制了产量和生产率，需要高效乙醛脱氢酶以平衡甘油脱水酶与脱氢酶的活性，减少3-HPA积累。
研究策略
从多种微生物中筛选17种候选乙醛脱氢酶，鉴定出来自Cupriavidus necator的新型乙醛脱氢酶GabD4；通过同源建模分析活性位点，采用定点突变和饱和突变对GabD4进行工程化改造，获得高活性突变体；同时敲除大肠杆菌的ackA-pta和yqhD基因以减少副产物，实现3-HP的高效生产。
研究路线图
核心内容
针对3-羟基丙酸（3-HP）生物合成中关键中间体3-羟基丙醛（3-HPA）毒性积累限制产量的瓶颈，该研究从多种微生物中筛选了17种候选乙醛脱氢酶，鉴定出来自Cupriavidus necator的新型酶GabD4，其对3-HPA的比活（55.5 U/mg）显著高于大肠杆菌内源AldH（33.2 U/mg）。通过同源建模与活性位点分析，研究者对GabD4进行定点突变和饱和突变，获得双突变体E209Q/E269Q，其Vmax提高至78.07 U/mg，催化效率（kcat/Km=162.34×10³ M⁻¹s⁻¹）约为野生型的1.4倍；同时确认C283为活性位点半胱氨酸。在菌株改造中敲除ackA-pta和yqhD基因以减少副产物，含突变体的菌株摇瓶产量达16.7 g/L，较含野生型的11.4 g/L提高1.6倍。最终在5 L生物反应器中实现71.9 g/L的3-HP产量和1.8 g/L/h的生产率，为当时文献报道最高值。该工作通过新型高活性酶筛选与结构指导的酶工程改造，结合副产物路径敲除，为工业级3-HP生物生产提供了高效酶催化剂和可行的代谢工程策略。
创新点
1. 首次报道来自Cupriavidus necator的乙醛脱氢酶GabD4对3-HPA具有迄今最高的酶活性；2. 通过结构指导的定点突变获得双突变体E209Q/E269Q，活性比野生型提高1.4倍；3. 通过组合策略在5 L生物反应器中实现71.9 g/L的3-HP产量和1.8 g/L/h的生产率，为当时文献报道最高值。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli W3110 | 3-HP生物合成途径 | gabD4 | GabD4 | 催化 | 来自Cupriavidus necator的乙醛脱氢酶，催化3-HPA氧化为3-HP，对3-HPA具有最高活性 |
| Escherichia coli W3110 | 3-HP生物合成途径 | gabD4(E209Q/E269Q) | GabD4_E209Q/E269Q | 催化 | 经定点突变获得的双突变体，比活较野生型提高1.4倍 |
| Escherichia coli W3110 | 3-HP生物合成途径 | aldH | AldH | 催化 | 大肠杆菌内源乙醛脱氢酶，作为对照酶 |
| Escherichia coli W3110 | 3-HP生物合成途径 | dhaB | DhaB | 催化 | 来自Klebsiella pneumoniae的甘油脱水酶，催化甘油脱水生成3-HPA |
| Escherichia coli W3110 | 3-HP生物合成途径 | gdrAB | GdrAB | 调控 | 来自Klebsiella pneumoniae的甘油脱水酶再活化因子，参与B12辅酶再生，调控DhaB活性 |
| Escherichia coli W3110 | 副产物代谢路径 | ackA-pta | AckA-Pta | 催化 | 本研究中被敲除，消除乙酸副产物生成，减少碳流失 |
| Escherichia coli W3110 | 副产物代谢路径 | yqhD | YqhD | 催化 | 本研究中被敲除，消除1,3-丙二醇副产物生成，减少3-HPA消耗 |
关键发现
- GabD4在37°C、pH 8下对3-HPA的比活为55.5 U/mg，高于E. coli AldH的33.2 U/mg
- 双突变体GabD4_E209Q/E269Q的Vmax为78.07 U/mg，kcat/Km为162.34×10^3 M^-1 s^-1，比野生型GabD4（55.12 U/mg，71.48×10^3）提高1.4倍
- 摇瓶培养中，含突变体的菌株SH501_E209Q/E269Q产量达16.7 g/L，比含野生型GabD4的SH401（11.4 g/L）高1.6倍
- 敲除ackA-pta和yqhD后，含aldH的菌株SH004产量为10.2 g/L，比未敲除的SH003（7.4 g/L）提高38%
- 5 L补料分批发酵中，SH501_E209Q/E269Q产量达71.9 g/L，生产率为1.8 g/L/h，比SH004（50.8 g/L）和SH401（60.1 g/L）高
- C283是GabD4的活性位点半胱氨酸，突变后酶活性丧失。
研究结论
通过鉴定新型乙醛脱氢酶GabD4并对其进行结构指导的突变改造，结合副产物路径敲除，显著提高了大肠杆菌中3-HP的生产水平，获得了当时文献报道的最高产量和生产率，为工业级3-HP生物生产提供了关键酶和策略。