NADPH-Dependent Reductive Biotransformation With Escherichia coli and Its pfkA Deletion Mutant: Influence on Global Gene Expression and Role of Oxygen Supply
- 作者
- Solvej Siedler, Stephanie Bringer, Tino Polen, Michael Bott
- 单位
- Institut für Bio- und Geowissenschaften, IBG-1: Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich, D-52425 Jülich, Germany
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2014）
- DOI
- 10.1002/bit.25271
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
研究大肠杆菌及其pfkA缺失突变体在NADPH依赖性还原性全细胞生物转化中的全球基因表达变化，以及氧供对生物转化效率和代谢状态的影响。
研究策略
以E. coli BL21(DE3)及其ΔpfkA突变体为底盘，表达Lactobacillus brevis的醇脱氢酶，催化甲基乙酰乙酸（MAA）还原为(R)-3-羟基丁酸甲酯（MHB）作为模型反应。采用DNA微阵列比较转录组，并在生物反应器中控制厌氧和15%溶解氧条件，测定生产速率、葡萄糖摄取率及氧/二氧化碳转移速率。
核心内容
该研究以大肠杆菌BL21(DE3)及其pfkA缺失突变体为底盘，表达来自短乳杆菌的醇脱氢酶，催化甲基乙酰乙酸还原为(R)-3-羟基丁酸甲酯作为模型反应，考察NADPH依赖性全细胞生物转化中的代谢与调控机制。通过DNA微阵列比较转录组，并在厌氧和15%溶解氧条件下测定生产速率、葡萄糖摄取率及呼吸参数。结果显示，厌氧条件下两菌株生产速率均为7.4 mmol h⁻¹ g_cdw⁻¹，好氧条件下分别提升至12.8和11.0 mmol h⁻¹ g_cdw⁻¹。ΔpfkA突变体葡萄糖摄取率显著低于参考菌株，好氧时MHB/葡萄糖产率达4.8 mol/mol，优于参考菌株的3.4。转录组分析揭示SoxRS体系对NADPH消耗的特异性响应，ΔpfkA中soxS mRNA诱导倍数达24.4，为参考菌株的5.3倍；sthA mRNA水平亦上调逾3倍。此外，ΔpfkA中可溶性转氢酶SthA活性被重组ADH竞争抑制，导致呼吸率下降但降低了氧需求。该工作阐明pfkA缺失通过强化磷酸戊糖途径提高NADPH供给效率，在降低供氧成本方面具有工业应用潜力。
创新点
1. 通过转录组分析揭示了SoxRS和ArcAB两个全局调控系统对NADPH消耗和呼吸状态的特异性响应；2. 首次阐明了ΔpfkA突变体中可溶性转氢酶SthA在氧消耗中的关键作用，其活性被重组ADH竞争抑制导致呼吸率下降；3. 证明ΔpfkA突变体在好氧条件下能获得更高的产物/葡萄糖产率，且需氧量更低，有利于降低成本。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) Star | 糖酵解/磷酸戊糖途径 | pfkA | 6-磷酸果糖激酶A | 催化 | 编码主要磷酸果糖激酶，缺失后导致PPP部分环化，提高NADPH/葡萄糖比例 |
| Escherichia coli BL21(DE3) Star ΔpfkA | 磷酸戊糖途径 | sthA | 可溶性转氢酶SthA | 催化 | 催化NADPH和NAD+之间的氢负离子转移，在突变体中mRNA水平上调3倍以上 |
| Escherichia coli BL21(DE3) Star | 还原性生物转化 | adh（来自Lactobacillus brevis） | 醇脱氢酶Lbadh | 催化 | 催化MAA还原为MHB，高活性NADPH依赖酶（17-28 U/mg蛋白） |
| Escherichia coli BL21(DE3) Star | 氧化应激响应 | soxS | 转录调控因子SoxS | 调控 | 受SoxR激活，NADPH消耗导致其表达增强，突变体中诱导更强烈 |
| Escherichia coli BL21(DE3) Star | 双组分调控系统 | arcA | ArcA响应调节因子 | 调控 | ArcAB系统感应醌池氧化还原状态，调控呼吸链基因表达 |
| Escherichia coli BL21(DE3) Star | 呼吸链 | cyoAB, cydAB | 细胞色素bo3氧化酶（Cyo）和细胞色素bd氧化酶（Cyd） | 能量供给 | 在ΔpfkA中cyo上调、cyd下调，表明ArcA活性差异，影响呼吸效率 |
关键发现
- 厌氧条件下，参考菌株和ΔpfkA突变体的MHB生产速率均为7.4 mmol h^-1 g_cdw^-1
- 好氧（15% DO）条件下，参考菌株和ΔpfkA突变体的MHB生产速率分别为12.8和11.0 mmol h^-1 g_cdw^-1，比厌氧条件下分别高73%和49%。ΔpfkA突变体的葡萄糖摄取率在厌氧和好氧条件下分别为2.4和2.3 mmol h^-1 g_cdw^-1，显著低于参考菌株的3.5和3.8，因此其MHB/葡萄糖产率更高，好氧条件下达4.8 mol/mol，而参考菌株为3.4。转录组分析显示，添加MAA后，ΔpfkA中soxS mRNA诱导倍数（24.4）是参考菌株（4.6）的5.3倍
- ΔpfkA中sthA mRNA水平增加3倍以上。好氧条件下，参考菌株在MAA添加后OTR上升，而ΔpfkA的OTR迅速降至零，直到MAA耗尽后才回升。
研究结论
pfkA缺失导致磷酸戊糖途径部分环化，提高了NADPH/葡萄糖比例，从而增强了NADPH依赖性还原性生物转化的产物产率。转录组和生理数据表明，SoxRS响应NADPH消耗，ArcAB响应呼吸状态。ΔpfkA突变体由于SthA被重组ADH竞争而呼吸受限，但对氧的需求更低，在工业应用中具有降低供氧成本的潜力。