Combinatorial Engineering of Mevalonate Pathway for Improved Amorpha-4,11-Diene Production in Budding Yeast
- 作者
- Jifeng Yuan, Chi Bun Ching
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, National University of Singapore
- 杂志
- Biotechnology and Bioengineering（2014）
- DOI
- 10.1002/bit.25123
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中优化甲羟戊酸途径代谢通量，以提高萜类化合物（特别是青蒿素前体amorpha-4,11-diene）的产量，并解决传统基因整合方法耗时费力的问题。
研究策略
构建新型δ-整合平台，通过调节抗生素（腐草霉素）浓度实现甲羟戊酸途径多个基因的多拷贝基因组整合；利用类胡萝卜素生物合成作为可视化筛选模块，构建突变体文库；随后将筛选出的类胡萝卜素高产菌株用于amorpha-4,11-diene生产测试。
研究路线图
核心内容
针对酿酒酵母中萜类前体供应不足的问题，该研究开发了一种基于δ整合位点的新型组合工程平台。通过调控腐草霉素浓度，实现了甲羟戊酸途径多个关键基因（包括ERG10、ERG13、tHMG1和ERG12）的多拷贝一轮整合，避免了传统方法逐基因操作的低效流程。同时借助类胡萝卜素途径作为可视化报告模块，快速筛选出甲羟戊酸通量增强的突变体文库。将筛选所得的高产菌株用于青蒿素前体amorpha-4,11-diene的发酵测试，最佳菌株M3-2nd的产量达到约64 mg/L石竹烯当量，较亲本菌株提高了13倍；另有两个类胡萝卜素高产株M7和M8在培养5天后产量达亲本的6倍。qPCR分析证实这些菌株中多个甲羟戊酸途径基因的mRNA水平显著上升。然而，研究发现类胡萝卜素颜色筛选存在局限，颜色强度与目标产量并非完全相关，且过高通量会导致颜色转变，提示未来需要发展更精确的生物传感器，并结合多轮工程策略进一步挖掘产量潜力。
创新点
['开发了基于δ-位点和抗生素浓度调节的多基因组合整合平台，可在一轮操作中实现多拷贝基因整合', '利用类胡萝卜素颜色作为筛选标记，构建了甲羟戊酸途径活性增强的突变体文库', '单轮组合工程获得amorpha-4,11-diene产量显著提高的菌株']
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径 | ERG10 | 乙酰-CoA乙酰转移酶 | 催化 | 过表达，将两分子乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径 | ERG13 | HMG-CoA合酶 | 催化 | 过表达，催化乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合生成HMG-CoA |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径 | tHMG1 | 截短的HMG-CoA还原酶 | 催化 | 过表达，限速步骤，催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径 | ERG12 | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | 过表达，催化甲羟戊酸磷酸化 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径 | ERG8 | 磷酸甲羟戊酸激酶 | 催化 | 过表达，催化磷酸甲羟戊酸磷酸化 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径 | ERG19 | 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 | 催化 | 过表达，催化甲羟戊酸焦磷酸脱羧生成IPP |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 甲羟戊酸途径 | IDI1 | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 过表达，催化IPP异构化为DMAPP |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 萜类前体合成途径 | ERG20 | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 过表达，催化IPP和DMAPP缩合生成GPP和FPP |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 类胡萝卜素合成途径 | crtYB | 八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶（双功能） | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，用于类胡萝卜素筛选模块 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 类胡萝卜素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 来自Xanthophyllomyces dendrorhous，用于类胡萝卜素筛选模块 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | amorpha-4,11-diene合成途径 | ADS | amorpha-4,11-diene合酶 | 催化 | 来自青蒿，催化FPP环化生成amorpha-4,11-diene |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 基因组整合位点 | δ序列 | — | 调控 | 利用Ty反转座子δ位点进行同源重组整合 |
关键发现
['获得最佳突变株M3-2nd，其amorpha-4,11-diene产量超过亲本菌株13倍，约为64 mg/L石竹烯当量', '在所有测试的8个类胡萝卜素高产菌株中，amorpha-4,11-diene产量均高于亲本，最好的M7和M8在培养5天后产量为亲本的6倍', 'qPCR分析确认M3-2nd菌株中erg10、erg13、thmg1和erg12基因的mRNA水平显著高于亲本菌株', '发现类胡萝卜素颜色筛选存在局限性：进一步提高甲羟戊酸途径活性导致颜色从橙色变为黄色，且颜色强度与产量不完全相关', 'PCR验证显示多个基因整合事件，例如M3菌株中检测到idi1、erg20及另一个未知基因的整合']
研究结论
本研究建立的δ-整合平台能够通过抗生素浓度调节实现甲羟戊酸途径基因的多拷贝组合整合，并成功获得amorpha-4,11-diene高产菌株。但类胡萝卜素颜色筛选方法存在局限性，未来需要开发更可靠的筛选传感器，并结合多轮组合工程、辅因子工程等策略进一步提高产量。